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被検体生物の同定方法、この方法に使用する内部標準用DNA組成物及びその製造方法

国内特許コード P110003944
整理番号 RJ008P06-1
掲載日 2011年7月4日
出願番号 特願2006-546647
登録番号 特許第5024784号
出願日 平成17年12月2日(2005.12.2)
登録日 平成24年6月29日(2012.6.29)
国際出願番号 2005JP022188
国際公開番号 WO2006/059717
国際出願日 平成17年12月2日(2005.12.2)
国際公開日 平成18年6月8日(2006.6.8)
優先権データ
  • 特願2004-350694 (2004.12.3) JP
発明者
  • 浜野 圭一
  • 幸塚 麻里子
  • モハメド ナイムディン
  • 西垣 功一
出願人
  • 独立行政法人科学技術振興機構
  • 国立大学法人埼玉大学
発明の名称 被検体生物の同定方法、この方法に使用する内部標準用DNA組成物及びその製造方法
発明の概要 遺伝子型による生物の同定方法であって、より規格化精度を高め、その結果、同定精度も高められた方法、及び規格化精度を高めるための手段を提供する。(1)被検体生物のゲノムを鋳型として調製した2本鎖DNAを温度勾配ゲル電気泳動または変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に付し、(2)得られた前記2本鎖DNAの電気泳動パターンから、前記2本鎖DNAの特徴点を抽出し、(3)抽出された特徴点に基づいて被検体生物の同定を行う方法。(4)前記2本鎖DNAのゲル電気泳動を、2種類の内部標準DNAとともに行い、(5)前記2種類の内部標準DNAの電気泳動パターンから各内部標準DNAの融解開始点を抽出し、これらの融解開始点を基準点として、前記特徴点を規格化し、かつ(6)規格化した特徴点に基づいて被検体生物の同定を行う。
従来技術、競合技術の概要 従来、微生物を含む生物の同定は、基本的に表現型を用いて行われて来た。しかし、表現型による同定は、生物をより精密に区別することを目的とする同定には不向きであった。特に、種の数が膨大である微生物においては、表現型による同定(特定)には、現実問題として限界があった。一方、日常生活において微生物が係わることは多い。例えば、O157、結核、MRSA、コレラなどの微生物が原因となる疾患は多く、有効な治療法の確立や、感染経路の把握のためには、微生物の精密な同定技術が必要である。また、農産物の生産性や品質に土壌細菌が係わり、あるいは、ヒトの健康に腸内細菌叢の良否が大きく影響していると言われている。しかるに、農産物の生産性や品質と土壌細菌の種類や量、組合せとの関係、さらにはヒトの健康と腸内細菌叢との関係について、精密な検討が行われていないのが現状である。これは、これまでのように表現型による微生物の同定では、精密な同定、判別が不可能であることに起因している。そこで、表現型に代わるものとして遺伝子型による微生物の同定が提案されている。

例えば、各微生物のゲノム(全体)同士を比較することにより微生物の種の同定、判別をすることは、現在のシーケンス技術レベルでは十分可能である。しかし、相当の手間と時間を掛ける必要が有り、簡便な方法ではない。従って、ゲノム(全体)同士の比較による微生物の種の同定、判別は、現実には広汎に行い得る方法ではない。また、より簡便な方法として、ゲノムの一部の配列比較をする方法がある。しかし、例えば、16S rRNAの配列比較では、種の同定、判別には十分な情報が得られない。

そこで本発明者らは、ある程度簡便で現実に実行可能である、遺伝子型による微生物等の生物について、種や類似性等を同定する方法を先に発明し、特許出願した(特開2001-299398号公報、特許文献1)。この方法では、ランダムPCRと電気泳動を組み合わせ、生物のゲノムの配列を比較することなく、遺伝子型により生物の同定を可能にした。

上記方法では、温度勾配ゲル電気泳動法や変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法等の二次元的ゲル電気泳動が用いられる。二次元的ゲル電気泳動は、核酸やタンパク質解析においてその分解能の高さゆえに有効である。しかしその分解能の高さの一方で、温度勾配装置の温度精度制御限界に起因する泳動毎の極わずかなゆらぎや、人の制御が不可能な極微の環境条件変化による泳動毎ゆらぎがある。これらのゆらぎに対して、既知の変性温度や移動度をもつシーケンスの核酸やタンパク質を共泳動させる内部標準試料を用いることで、補正・規格化が可能となる。上記特許文献1に記載の方法においても、内部標準DNAを用い、データを規格化することを提案している。

産業上の利用分野 本発明は、被検体生物の同定方法、この方法に使用する内部標準用DNA組成物及びその製造方法に関する。特に本発明は、ランダムPCRと電気泳動を組み合わせた遺伝子型による被検体生物の同定方法において、2種類の内部標準DNAを用い、被検体生物の同定精度を高めた方法である。

特許請求の範囲 【請求項1】
(1)被検体生物のゲノムを鋳型として調製した2本鎖DNAを温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)または変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)に付し、
(2)得られた前記2本鎖DNAの電気泳動パターンから、前記2本鎖DNAの特徴点を抽出し、
(3)抽出された特徴点に基づいて被検体生物の同定を行う方法であって、
(4)前記2本鎖DNAのゲル電気泳動を、前記2本鎖DNAに添加した、配列表に示す配列番号2の配列を有するDNA及び配列番号3の配列を有するDNAの組み合わせ、または配列表に示す配列番号4の配列を有するDNA及び配列番号5の配列を有するDNAの組み合わせである2種類の内部標準DNAとともに行い、
(5)前記2種類の内部標準DNAの電気泳動パターンから各内部標準DNAの融解開始点を抽出し、これらの融解開始点を基準点として、前記特徴点を規格化し、かつ
(6)規格化した特徴点に基づいて被検体生物の同定を行う
ことを特徴とする前記方法。

【請求項2】
(1)前記2本鎖DNAの調製は、ランダムPCRにより行われ、1種又は2種以上の2本鎖DNAが調製される、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
ランダムPCRが、熱変性、アニーリング及び鎖伸長を繰り返し行うPCRであって、アニーリングを25℃~35℃で1~2分で行い、かつ鎖伸長を42℃~47℃で1~2分で行う請求項2に記載の方法。

【請求項4】
前記2本鎖DNAの特徴点が、各2本鎖DNAの融解開始点である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
(5)で得られた規格化した特徴点群からPaSS及び/又はゲノム準距離を求め、得られたPaSS及び/又はゲノム準距離に基づいて、被検体生物の同定を行う請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項6】
生物の同定が、生物の種同定又は類縁性同定である請求項1~のいずれか1項に記載の方法。

【請求項7】
被検体生物が微生物である請求項1~のいずれか1項に記載の方法。

【請求項8】
配列表に示す配列番号2の配列を有するDNA及び配列番号3の配列を有するDNAの組み合わせ、または配列表に示す配列番号4の配列を有するDNA及び配列番号5の配列を有するDNAの組み合わせを含む、請求項1に記載の被検体生物同定方法に用いるための内部標準用DNA組成物。

【請求項9】
配列表に示す配列番号4の配列を有するDNA及び配列番号5の配列を有するDNAを含む、請求項1に記載の被検体生物同定方法に用いるための内部標準用DNA組成物の製造方法であって、
pBR322DNAを鋳型DNAとし、配列番号4の配列を有するDNA増幅用のプライマーセット及び配列番号5の配列を有するDNA増幅用のプライマーセットを用いてPCR反応を行うことを特徴とする方法。

【請求項10】
配列番号4の配列を有するDNA増幅用のプライマーセットが、配列番号12及び配列番号13の配列を有するDNAからなり、配列番号5の配列を有するDNA増幅用のプライマーセットが、配列番号14及び配列番号15の配列を有するDNAからなる請求項に記載の方法。

【請求項11】
PCRサイクル条件として、
a前熱変性(95℃,2分)、
b熱変性(94℃,15秒)、
cアニーリング(55℃,30秒)、
d鎖伸長(72℃,30秒)、
eポスト鎖伸長(72℃,30秒)
を用い、かつb~dを25回繰り返す請求項または10に記載の方法。

【請求項12】
配列表に示す配列番号2の配列を有するDNAおよび配列番号3の配列を有するDNAを含む、請求項1に記載の被検体生物同定方法に用いるための内部標準DNA組成物の製造方法であって、fd(M13)ファージDNAを鋳型DNAとし、配列番号2の配列を有するDNA増幅用のプライマーセット及び配列番号3の配列を有するDNA増幅用プライマーセットを用いてPCR反応を行うことを特徴とする方法。

【請求項13】
配列番号2の配列を有するDNA増幅用のプライマーセットが、配列番号8及び配列番号9の配列を有するDNAからなり、配列番号3の配列を有するDNA増幅用のプライマーセットが、配列番号10及び配列番号11の配列を有するDNAからなる請求項12に記載の方法。

【請求項14】
PCRサイクル条件として、
a前熱変性(94℃,5分)、
b熱変性(94℃,30秒)
cアニーリング(64℃~65℃,30秒)
d鎖伸長(74℃,30秒)
eポスト鎖伸長(74℃,5分)
を用い、かつb~dを30回繰り返す請求項12または13に記載の方法。

【請求項15】
請求項に記載の内部標準用DNA組成物を含む、請求項1に記載の被検体生物同定方法に用いるための被検体生物同定用キット。
国際特許分類(IPC)
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