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ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法および用途 新技術説明会

国内特許コード P110004063
整理番号 RJ009P35
掲載日 2011年7月6日
出願番号 特願2007-328060
公開番号 特開2009-149549
登録番号 特許第5210620号
出願日 平成19年12月19日(2007.12.19)
公開日 平成21年7月9日(2009.7.9)
登録日 平成25年3月1日(2013.3.1)
発明者
  • 西垣 功一
  • 吉田 昼也
  • 北村 幸一郎
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
  • 国立大学法人埼玉大学
発明の名称 ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法および用途 新技術説明会
発明の概要 【課題】
標的タンパク質に高度に相互作用する有用なペプチドアプタマーを数多くプールすることを可能とする、ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法を提供すること。
【解決手段】
上記課題を解決するために、標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、統計学的なクラスター解析およびブロックシャッフリング法を利用する工程を含む、前記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法が提供される。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要


ペプチドとは、2以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものの総称である。タンパク質間相互作用は、本質的にペプチド間相互作用である生理学的現象を基盤とする。したがって、ペプチドの中でも、特に酵素や受容体などのタンパク質に相互作用するペプチド(ペプチドアプタマー)は、酵素と疾患の関連性を解明する上でも非常に有用な研究対象であり、抗体医薬に続く有望な分子として期待されている。



これまでにペプチドアプタマーの研究は、組み合わせ合成、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよびmRNAディスプレイなどの手法を用いて実施されてきた(非特許文献1~4)。ファージディスプレイは、ビリオン粒子の表面にファージDNAにコードされたペプチドを表示する手法であり、新規なタンパク質およびペプチドをもたらすことに成功している。



しかし、ファージディスプレイは、処理できるペプチドおよび多様性の数が制限されるという問題があった。そこで、現在はリボソームディスプレイやmRNAディスプレイなどのインビトロシステムの開発が進められている。これまでにインビトロシステムを利用して、処理できるペプチドの分子スペクトルを拡張し、さらに1012-15(ファージ・ディスプレイは10)にまで分子の多様性を拡大化することに成功している(非特許文献3および4)。
【非特許文献1】
Acharya, A. N., Nefzi, A., Ostresh, J. M. & Houghten, R. A. (2001). J. Comb.Chem. 3, 189-195.
【非特許文献2】
Smith, G. P. (1985). Science. 228, 1315-1317.
【非特許文献3】
Hanes, J. & Pluckthun, A. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4937-4942.
【非特許文献4】
Roberts, R. W. & Szostak, J. W. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297-12302.

産業上の利用分野


本発明は、高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法に関する。より詳しくは、本発明は、第一のペプチドアプタマー群を統計解析およびブロックシャッフリング法で処理することにより、高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを回収することを特徴とする、上記ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法に関する。



さらに本発明は、上記ペプチドアプタマーライブラリーを利用して、より高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーを作製する方法に関する。さらに、本発明は、上記いずれかのライブラリーを利用して、最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーまたはコンビネーションペプチドアプタマーをスクリーニングする方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを含むペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーからなる第一の群のアミノ酸配列を統計学的にクラスター解析する工程、但し、前記クラスター解析が、7個、8個または9個のアミノ酸からなるアミノ酸配列間ハミング距離に基づいてアミノ酸配列をクラスタリングする手法である、
各クラスター内の共通アミノ酸配列を抽出する工程、
前記共通アミノ酸配列を4個、5個または6個のアミノ酸からなるブロックに分け、得られたブロックの2以上を用いたブロックシャッフリング法によりペプチドアプタマーからなる第二の群を得る工程、および
前記第一の群に含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーを、前記第二の群から回収し、前記ペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。

【請求項2】
前記クラスター解析が、8個または9個のアミノ酸からなるアミノ酸配列間ハミング距離に基づいてアミノ酸配列をクラスタリングする手法である、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
前記第二の群を得る工程において、前記共通アミノ酸配列を4個のアミノ酸からなるブロックに分ける、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
前記ブロックシャッフリング法が、Y連結に基づくブロックシャッフリング(Y-ligation-based block shuffling:YLBS)法である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
前記標的タンパク質の相互作用が、標的タンパク質の活性を促進する作用または標的タンパク質の活性を阻害する作用である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項6】
前記標的タンパク質がアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼまたは金属プロテアーゼである、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。

【請求項7】
前記アスパラギン酸プロテアーゼがカテプシンDまたはカテプシンEであり;前記システインプロテアーゼがカテプシンBであり;または前記セリンプロテアーゼがトリプシンである、請求項6に記載の方法。

【請求項8】
標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
請求項1~7のいずれか1項に記載の方法でペプチドアプタマーライブラリーを作製し、作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも2種のペプチドアプタマーを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第三の群を作製する工程、および
前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第三の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。

【請求項9】
標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを含むコンビネーションペプチドアプタマーライブラリーの作製方法であって、
請求項1~7のいずれか1項に記載の方法でペプチドアプタマーライブラリーを作製し、作製されたペプチドアプタマーライブラリーから選ばれる少なくとも1種のペプチドアプタマーと、任意の少なくとも1種の標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーとを、スペーサーを介して連結させたコンビネーションペプチドアプタマーからなる第四の群を作製する工程、および
前記ペプチドアプタマーライブラリーに含まれるペプチドアプタマーの中で最も高度に標的タンパク質に相互作用するペプチドアプタマーと同等またはそれよりも高度に標的タンパク質に相互作用するコンビネーションペプチドアプタマーを、前記第四の群から回収し、前記コンビネーションペプチドアプタマーライブラリーに含める工程
を含む、前記方法。

【請求項10】
前記スペーサーを介した連結が、ペプチドペアライブラリー法により達成される連結である、請求項8または9に記載の方法。

【請求項11】
前記スペーサーが、配列表の配列番号1~3からなる群から選ばれる配列のスペーサーである、請求項8~10のいずれか1項に記載の方法。

【請求項12】
前記タンパク質が酵素または受容体である、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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