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抗原濃度測定法

国内特許コード P110004418
整理番号 K022P43
掲載日 2011年7月13日
出願番号 特願2009-525286
登録番号 特許第5137266号
出願日 平成20年7月30日(2008.7.30)
登録日 平成24年11月22日(2012.11.22)
国際出願番号 JP2008002049
国際公開番号 WO2009016839
国際出願日 平成20年7月30日(2008.7.30)
国際公開日 平成21年2月5日(2009.2.5)
優先権データ
  • 特願2007-201147 (2007.8.1) JP
発明者
  • 上田 宏
  • 小嶋 美樹
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 抗原濃度測定法
発明の概要 本発明は、検出対象である抗原が低分子抗原であっても、より簡便、効率的、安定性良くかつ高感度で検出し得る検出方法を提供することを目的としている。抗体のV領域を含むポリペプチド;所定のタンパク質;リンカーペプチド:前記タンパク質と結合する活性を有し、前記タンパク質との結合の有無が検出可能であるパートナータンパク質;及び、前記抗体のV領域を含むポリペプチド;をこの順又はこの順の逆の順で含んでなり、かつ、前記V領域を含むポリペプチド及びV領域を含むポリペプチドの抗原に対する結合の有無により前記タンパク質と前記パートナータンパク質の結合の有無が生じる融合タンパク質を用いて、抗原の検出を行う。
従来技術、競合技術の概要


抗体を用いた免疫測定法として、酵素標識固相免疫測定法(ELISA)等が広く用いられている。しかし、抗原が低分子である場合は、第一に抗体の抗原結合部位(パラトープ)と抗原との界面積が小さくなるため、第二に抗原が小さすぎて感度の良いサンドイッチ法が適用できず競合法によって測定せざるを得ないため、ELISA法等は低分子抗原に対しては感度が低下するという問題があった。そのため、低分子抗原についても非競合的に高感度で測定し得る方法が開発されている。



例えば、非特許文献1には、低分子である4-hydroxy-3-nitrophencetyl(NP)を高感度で検出する方法であって、NPに結合するB1-8抗体のV領域ポリペプチド及び大腸菌βガラクトシダーゼのαフラグメントからなる融合タンパク質(V領域ポリペプチドはαフラグメントのN末端側に結合)と、前記抗体のV領域ポリペプチド及び大腸菌βガラクトシダーゼのωフラグメントからなる融合タンパク質(V領域ポリペプチドはωフラグメントのN末端側に結合)とを用いた方法が開示されている。この方法は、一方の融合タンパク質におけるV領域ポリペプチドと、他方の融合タンパク質におけるV領域ポリペプチドが、NP抗原を介して相互作用すると、両融合タンパク質におけるαフラグメントとωフラグメントが結合し、その結果生じるβガラクトシダーゼ活性の上昇(いわゆる活性相補)を検出することによって、NP抗原の検出を行う。この方法により、低分子抗原についても、従来のELISA法に比べて高感度で測定することが可能となった。また、この方法は、通常のELISA法とは異なり、結合しなかった標識2次抗体(非競合法)や標識抗原(競合法)などを洗浄する操作を要することなく測定し得る測定法(ホモジニアス法)であり、測定装置の自動化が容易で迅速な測定が可能という点で、通常のELISA法に比べてメリットがあった。しかし、この方法により高感度で測定するには、用いる両融合タンパク質の濃度設定をある程度正確に行う必要があるなど、検出の簡便性、効率性、安定性などに関して改善の余地があった。



【非特許文献1】
Anal. Chem., 74, 2500-2504 (2002)

産業上の利用分野


本発明は、抗体酵素融合タンパク質、及び、該抗体酵素融合タンパク質を用いた抗原の検出方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
抗体のV領域を含むポリペプチド;所定のタンパク質;リンカーペプチド:前記タンパク質と結合する活性を有し、前記タンパク質との結合の有無が検出可能であるパートナータンパク質;及び、前記抗体のV領域を含むポリペプチド;をこの順又はこの順の逆の順で含んでなり
所定のタンパク質とパートナータンパク質との組み合わせが、βラクタマーゼのN末端側フラグメントを含むタンパク質とβラクタマーゼのC末端側フラグメントを含むタンパク質との組み合わせであり、
前記V領域を含むポリペプチド及びV領域を含むポリペプチドの抗原に対する結合の有無により前記タンパク質と前記パートナータンパク質の結合の有無が生じ、及び、
前記タンパク質と前記パートナータンパク質の結合の有無を、βラクタマーゼのβラクタマーゼ活性の変化により検出可能であることを特徴とする
融合タンパク質。

【請求項2】
リンカーペプチドが、Asp-Lys-Serからなるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項1に記載の融合タンパク質

【請求項3】
βラクタマーゼのN末端側フラグメントを含むタンパク質が、配列番号5に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、βラクタマーゼのC末端側フラグメントを含むタンパク質が、配列番号7に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項1又は2に記載の融合タンパク質。

【請求項4】
所定のタンパク質;リンカーペプチド:パートナータンパク質の配列が、配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項1~のいずれかに記載の融合タンパク質。

【請求項5】
請求項1~のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするDNA。

【請求項6】
請求項に記載のDNAを有する組換えベクター。

【請求項7】
請求項に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換細胞。

【請求項8】
サンプル中の抗原を検出する方法であって、V領域を含むポリペプチド及びV領域を含むポリペプチドが前記抗原に結合し得る請求項1~のいずれかに記載の融合タンパク質又は請求項に記載の形質転換細胞をサンプルに接触させる工程、及び、前記融合タンパク質又は前記形質転換細胞が発現する融合タンパク質における所定のタンパク質とパートナータンパク質の結合を、βラクタマーゼのβラクタマーゼ活性の変化により検出する工程を有することを特徴とする抗原の検出方法。

【請求項9】
所定のタンパク質とパートナータンパク質が、互いに結合していない場合に比べて互いに結合すると所定のタンパク質及び/又はパートナータンパク質が発揮するβラクタマーゼ活性が変化するタンパク質である請求項1~のいずれかに記載の融合タンパク質又は請求項に記載の形質転換細胞;及び、前記βラクタマーゼ活性の変化を検出し得る発色基質又は発光基質;を備えたことを特徴とする抗原の検出用キット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
参考情報 (研究プロジェクト等) さきがけ 構造機能と計測分析 領域
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