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DNA合成酵素 実績あり

国内特許コード P110004548
整理番号 E044P03
掲載日 2011年7月20日
出願番号 特願平09-332100
公開番号 特開平11-155578
登録番号 特許第3880173号
出願日 平成9年12月2日(1997.12.2)
公開日 平成11年6月15日(1999.6.15)
登録日 平成18年11月17日(2006.11.17)
発明者
  • 土居 洋文
  • 金井 昭夫
  • 石野 良純
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
  • セレスター・レキシコ・サイエンシズ株式会社
発明の名称 DNA合成酵素 実績あり
発明の概要 【課題】 DNA鎖をPCR等により増幅するに際して、鋳型DNA鎖の全長を効率よく増幅することのできる新規なDNA合成酵素と、この酵素の製造方法を提供する。
【解決手段】 1本鎖DNAに相補的なDNA鎖の合成を触媒するに際して合成DNA鎖がより長く伸長するようにPfuDNA合成酵素のアミノ酸配列を人為的に改変したことを特徴とするDNA合成酵素と、配列番号1または2のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含む発現ベクターにより形質転換した細胞を培養し、培地中に産生された目的酵素を単離・精製することを特徴とするDNA合成酵素の製造方法。
従来技術、競合技術の概要


DNA合成酵素(DNA polymerase)は1本鎖DNAに相補的なDNA鎖の合成を触媒する酵素の総称である。DNAの塩基配列決定や試験管内でのDNA増幅などには必須の酵素であるが、特にPCR(Polymerase chain reaction) においては、その一連の反応サイクルを自動化する上で「耐熱性DNA合成酵素」は不可欠である。



このような耐熱性DNA合成酵素としては、Taq、Pfu、KOD等が知られており、それぞれの特性に応じて使い分けられている。特に、PfuDNA合成酵素はDNA鎖合成時における読み違いが極めて少ない(忠実性が高い)酵素として知られている。
しかしながら、このPfuDNA合成酵素は、合成量が少なく、また合成鎖に対する伸長活性が不十分であるために、ゲノムDNA等の高分子DNAを増幅するには不適当であった。



この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、DNA鎖をPCR等により合成、増幅するに際して、PfuDNA合成酵素の特徴である高忠実性を維持しつつ、鋳型DNA鎖をより長く効率的に増幅することのできる新規な耐熱性DNA合成酵素を提供することを目的としている。
またこの発明は、このDNA合成酵素をコードするDNA配列と、このDNA配列の発現産物として上記DNA合成酵素を製造する方法を提供することを目的としている。

産業上の利用分野


この発明は、DNA鎖の試験管内での合成や増幅、塩基配列の決定等に用いる新規なDNA合成酵素と、この酵素をコードするDNA配列、並びにこのDNA合成酵素の製造方法に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
1本鎖DNAに相補的なDNA鎖の合成を触媒するに際して合成DNAがより長く伸長するようにアミノ酸配列を人為的に改変したPfuDNA合成酵素であって、野生型PfuDNA合成酵素のアミノ酸配列における第2位IleValに、第717位LeuProにそれぞれ置換した、配列番号2のアミノ酸配列からなる改変型PfuDNA合成酵素。

【請求項2】
さらに、第710位ProArgに、第712位SerArgに、第713位LeuProにそれぞれ置換した、配列番号1のアミノ酸配列からなる請求項1の改変型PfuDNA合成酵素。

【請求項3】
配列番号2のアミノ酸配列をコードするDNA

【請求項4】
配列番号1のアミノ酸配列をコードするDNA

【請求項5】
請求項3のDNAを含む組換え体ベクター。

【請求項6】
請求項4のDNAを含む組換え体ベクター。

【請求項7】
大腸菌HMS174(DE3)/pDP5C4(FERM BP-6190)が保有する組換え体プラスミドpDP5C4である請求項5の組換え体ベクター。

【請求項8】
大腸菌HMS174(DE3)/pDP5b17(FERM BP-6189)が保有する組換え体プラスミドpDP5b17である請求項6の組換え体ベクター。

【請求項9】
請求項3または4に記載のDNAを含む発現ベクターにより形質転換した細胞を培養し、培地中に生産された目的酵素を単離・精製することを特徴とする改変型PfuDNA合成酵素の製造方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
参考情報 (研究プロジェクト等) ERATO 土居バイオアシンメトリプロジェクト 領域
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