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光応答性プローブを用いたメチルシトシンの検出法

国内特許コード P110004620
整理番号 RX02P40
掲載日 2011年7月25日
出願番号 特願2010-502724
登録番号 特許第4951116号
出願日 平成21年3月11日(2009.3.11)
登録日 平成24年3月16日(2012.3.16)
国際出願番号 JP2009001090
国際公開番号 WO2009113303
国際出願日 平成21年3月11日(2009.3.11)
国際公開日 平成21年9月17日(2009.9.17)
優先権データ
  • 特願2008-063290 (2008.3.12) JP
発明者
  • 藤本 健造
  • 荻野 雅之
  • 田屋 悠太
出願人
  • 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
発明の名称 光応答性プローブを用いたメチルシトシンの検出法
発明の概要

本発明はDNA中のメチルシトシンを、迅速、簡便に、高感度で検出する方法を提供する。
本発明は塩基部分として式I、式II、式III、又は式IVで表される基を有する核酸類からなるメチルシトシン光連結剤(光応答性プローブ)を用いたメチルシトシンの検出方法に関する。

従来技術、競合技術の概要


DNAのメチル化は、DNAを構成する塩基のひとつ「シトシン」に対して生じる反応で、いつ・どの遺伝子からタンパク質を作るのかを制御し、タンパク質合成に必要なRNAへの転写ステップを正しく調節している。このシトシンのメチル化(5-メチルシトシンの生成)は、遺伝子の塩基配列によらずに、例えば遺伝子の働きを不活性化する役割を果たすが、異常を起こすと発がんへ至ることも知られている。塩基配列ではなく後天的な作用によって形質発現の調節機構に影響を与えるという観点、すなわち、エピジェネティクスの観点から、シトシンのメチル化はおいて極めて重要な現象である。



そのために、メチル化が発生するDNAの位置や、その量は正常なのかを即時に計測することが必要である。特に、例えば、医療の現場においてDNAメチル化を測定する場合には、迅速かつ正確に判定結果が得られることが求められる。



従来のメチルシトシン(5-メチルシトシン)の検出の方法としては、亜硫酸水素塩処埋による方法が知られている。この亜硫酸水素塩処埋による方法では、被験試料であるDNAに対して亜硫酸水素塩処埋の後に、PCR、シーケンシング操作を行い、これによってメチル化されたシトシンはシトシンとして検出され、メチル化されていないシトシンは、チミンとして検出される。このような亜硫酸水素塩処埋による検出は、例えば特許文献1(特表2004-511235号公報)に開示されている。しかし、このような亜硫酸水素塩処理は、長時間の加熱反応が必要で、大半のゲノムサンプルで非特異的損傷が生じ、これによるエラー(誤検出)も発生するという欠点があった。



従来のメチルシトシンの検出の方法としては、亜硫酸水素塩処埋による方法の他に、メチルシトシン感受性の制限酵素と非感受性の制限酵素を使用する方法(MIAMI法)が知られている。この方法では、メチルシトシン感受性の制限酵素と非感受性の制限酵素を使い分け、さらにPCR等を用いて検出を行う。しかし、酵素反応を使用するために、検出操作は煩雑であり、検出までに数日の時間を要するという欠点があった。

【特許文献1】特表2004-511235号公報

産業上の利用分野


本発明は、光応答性プローブ(メチルシトシン光連結剤)を用いたメチルシトシンの検出法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】 塩基部分として、次の式I、式II、式III、又は式IV:
【化学式1】
(ただし、式I中、Xは、O、SまたはNHを示し、
R1及びR3は、それぞれ独立に、水素、C1~C6のアルキル基、C1~C6のアルコキシ基、シアノ基、又はC1~C6のアシル基を示し、
R2は、C1~C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
【化学式2】
(ただし、式II中、R4及びR6は、それぞれ独立に、水素、C1~C6のアルキル基、C1~C6のアルコキシ基、シアノ基、又はC1~C6のアシル基を示し、
R5は、C1~C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
【化学式3】
(ただし、式III中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示し、YがNHであるときは水素原子を示し、
R7及びR9は、それぞれ独立に、水素、C1~C6のアルキル基、C1~C6のアルコキシ基、シアノ基、又はC1~C6のアシル基を示し、
R8は、C1~C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
【化学式4】
(ただし、式IV中、R10及びR12は、それぞれ独立に、水素、C1~C6のアルキル基、C1~C6のアルコキシ基、シアノ基、又はC1~C6のアシル基を示し、
R11は、C1~C12の炭素数を有する疎水性基を示す。)
で表される基を有する核酸類(ただし、核酸類、核酸、又はペプチド核酸である)からなる、メチルシトシン光連結剤。
【請求項2】 R2,R5,R8及びR11が、C1~C12の炭素数を有する炭化水素基である、請求項1に記載の核酸類(ただし、核酸類、核酸、又はペプチド核酸である)からなる、メチルシトシン光連結剤。
【請求項3】 請求項1~2の何れかに記載の核酸類からなる、光応答性メチルシトシン検出剤。
【請求項4】 請求項1~2の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを光連結する方法。
【請求項5】 請求項1~2の何れかに記載の核酸類を使用して、メチルシトシンを検出する方法。
【請求項6】 請求項1又は請求項2に記載の式I、式II、式III、又は式IVで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、及び、
メチルシトシンを有する被験核酸を、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸と、ハイブリダイズする工程、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸とハイブリダイズすることによって、近接して配置された被験核酸と、固定化された核酸又はペプチド核酸とに対して、光照射を行って、被験核酸を、固定化された核酸又はペプチド核酸に光連結する工程、
ハイブリダイズしていた鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸を、解離して除去する工程、
固定化された核酸又はペプチド核酸に連結した被験核酸と、
被験核酸にハイブリダイズ可能な核酸又はペプチド核酸であって、標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸とを、ハイブリダイズする工程、
標識核酸又は標識ペプチド核酸が有する標識部位を、検出する工程、
を含む、被験核酸中のメチルシトシンを検出する方法。
【請求項7】 鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸が、固定化された核酸又はペプチド核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列、及び被験核酸の一部又は全部の配列とハイブリダイズ可能な配列を有し、
これらのハイブリダイズ可能な配列が、固定化された核酸又はペプチド核酸、及び被験核酸を、ハイブリダイズした場合に、被験核酸のメチルシトシンと、固定化された核酸又はペプチド核酸の式I、式II、式III、又は式IVで表される基とが、隣接して配置される配列である、請求項に記載の方法。
【請求項8】 標識部位が、蛍光色素、ビオチン、ハプテン、酵素、フェロセン、スピン活性化合物、及び放射性物質からなる群より選択された標識によって標識されている、請求項の何れかに記載の方法。
【請求項9】 請求項1又は請求項2に記載の式I、式II、式III、又は式IVで表される基を塩基部分として末端に有する核酸又はペプチド核酸であって、担体に固定化された核酸又はペプチド核酸、
鋳型核酸又は鋳型ペプチド核酸、及び、
標識部位を有する標識核酸又は標識ペプチド核酸、
を含んでなる、メチルシトシン検出用キット。
産業区分
  • 微生物工業
  • 有機化合物
  • 治療衛生
  • 省エネルギー
  • 試験、検査
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2010502724thum.jpg
出願権利状態 権利存続中
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