TOP > 国内特許検索 > 胚性幹細胞のインスリン分泌細胞への分化誘導方法、該方法により誘導されるインスリン分泌細胞およびその用途

胚性幹細胞のインスリン分泌細胞への分化誘導方法、該方法により誘導されるインスリン分泌細胞およびその用途 コモンズ

国内特許コード P110005317
掲載日 2011年8月18日
出願番号 特願2006-326261
公開番号 特開2009-225661
登録番号 特許第5135577号
出願日 平成18年12月1日(2006.12.1)
公開日 平成21年10月8日(2009.10.8)
登録日 平成24年11月22日(2012.11.22)
発明者
  • 小林 直哉
  • リヴァス カリーヨ ホルヘデイヴィッド
  • 田中 紀章
出願人
  • 国立大学法人 岡山大学
発明の名称 胚性幹細胞のインスリン分泌細胞への分化誘導方法、該方法により誘導されるインスリン分泌細胞およびその用途 コモンズ
発明の概要

【課題】充分に機能的であり、大量供給が可能で安全なインスリン分泌細胞ならびに該細胞を用いた糖尿病治療薬、バイオ人工膵臓、研究試薬および創薬モデル動物を提供すること。
【解決手段】アクチビンを用いて未分化なES細胞から分化させた胚体内胚葉を、馴化培地を用いてニューロジェニン3発現細胞へ分化させたのちに該細胞を高グルコース培地で刺激することにより、インスリン分泌細胞へ効率的に分化誘導する方法、特には(a)線維芽細胞増殖因子およびアクチビンの存在下に胚性幹細胞を培養することにより胚体内胚葉へ分化させる工程、(b)得られた胚体内胚葉を、線維芽細胞増殖因子の存在下、馴化培地を用いて培養することにより原始膵へ分化させる工程、(c)得られた原始膵を、馴化培地を用いて培養することによりニューロジェニン3発現細胞数を増加させ、ニューロジェニン3発現細胞を得る工程、および(d)得られたニューロジェニン3発現細胞を、高グルコース濃度の無血清細胞培養用培地中で刺激してインスリン分泌細胞へ分化させる工程を含む方法、該方法により誘導されたインスリン分泌細胞、該細胞を含有する糖尿病治療薬、バイオ人工膵臓、研究試薬および創薬モデル動物。
【選択図】なし

従来技術、競合技術の概要


2000年カナダ・エドモントンのアルバータ大学から臨床膵島移植7症例についての報告がなされた(非特許文献1参照)。後に‘エドモントン・プロトコール’と呼ばれる免疫抑制剤の斬新な使用法によって膵島移植を受けた全ての1型糖尿病症例でインスリン療法から離脱できたと言うものである。膵島移植はインスリン依存型糖尿病患者にとって現在もっとも理想に近い治療法である。膵臓は外分泌腺と内分泌腺から構成されている。膵臓全容積の98%以上を外分泌腺が占め、内分泌腺は2%以下である。1869年ランゲルハンスによって見いだされた内分泌腺組織は、光学顕微鏡像において外分泌腺組織の海の中に浮かぶように存在する島のように見えることから膵島(islet)と呼ばれる。膵島は内分泌細胞の集団であり、α細胞、β細胞、PP細胞、δ細胞などからなっている。体内のホルモンで唯一血糖を下げる作用をもつインスリンは膵島のβ細胞から分泌される。この膵島を膵臓から単離し、インスリン依存型糖尿病の患者に移植して一旦廃絶した血糖降下システムの置換再生を目指すのが膵島移植である。β細胞は膵島を構成する全細胞の80~85%を占めている。β細胞は単にインスリンを分泌するのみではない.さらに重要なのは、血中の糖分を感知することができると言うことである。糖代謝におけるインスリン分泌調節の主体は複数の器官が関与した複雑な系に依存していない。すなわち膵島単独で運動時や摂食時などの急激に変化する血糖に対して迅速に反応し、それにみあった適量のインスリンを分泌することによって血糖を非常に狭い範囲に調節することが可能である。効果対象の感知と作用の調節が一種類の細胞単独でおこなわれ、その細胞が膵島の大部分を占めていると言う事実が膵島移植の理論的根拠となっている。



膵島単離成功の是非は、単離に用いる膵臓自体の善し悪しにかかっている。良好な膵島単離のためには外分泌腺組織の状態も良い必要がある。膵島単離を目的とした膵臓摘出には想像以上の繊細さが要求される。例えば、膵臓にさわって圧力をかけるだけでも、膵外分泌細胞はその含有酵素である蛋白分解酵素が放出されるため自己融解がはじまる。また、遠隔地で膵臓が摘出された場合、膵島単離施設までの輸送中の保存についても充分な配慮が必要となる。



インスリンの不足あるいは欠乏がその原因となっている糖尿病が膵島移植の適応となる。活性の低下の原因に基づいて糖尿病は大きく二つに分類される。一つは何らかの原因によって膵β細胞が破壊、障害されてインスリンの分泌がなくなるもの、もう一つは血中にインスリンが正常あるいは正常以上に存在するのだがインスリン抵抗性が末梢組織に存在するためインスリンの作用が低下しているものである。前者が1型糖尿病あるいは若年型糖尿病、後者が2型糖尿病と呼ばれる。膵島移植の適応は1型糖尿病である。2型糖尿病においても病期が進むと糖毒性やβ細胞の疲弊によってインスリンの不足を来すが、2型糖尿病は現在のところ膵島移植の適応とはなっていない。理由は、インスリンの分泌がある程度保たれている2型糖尿病に対してインスリンがほとんど分泌されていない1型糖尿病ではインスリン療法による血糖調節が非常に困難であること、2型糖尿病はその病態の基盤にインスリン抵抗性をもつため膵島移植の効果が懸念されるためである。2型糖尿病でも血糖の厳格な調節は予後に良好に働くが、移植膵島の不足と言う厳然たる事実があり1型糖尿病のみが膵島移植の対象となっている。将来移植膵島の供給が豊富となるような状況下では、インスリン抵抗性を契機としたインスリン非依存型糖尿病もその適応となる可能性は充分にある。



統計によると欧米では年間人口比(10万人中)12人から35人(日本では1.5人)が1型糖尿病を発症している。欧米社会において糖尿病は解決すべき大きな社会問題である。糖尿病の一次予防と、合併症の二次予防のための対策が急務であると言える。



1993年に糖尿病コントロールと合併症に関する臨床試験(Diabetes Control and Complications Trial,DCCT)によるインスリン強化療法の合併症に対する効果が発表されている(非特許文献2参照)。これは、可能な限り厳格なインスリン療法であるインスリン強化療法によって長期合併症の予防が可能かどうかとの疑問に対する臨床試験である。インスリン強化療法は従来のインスリン療法に比べて長期合併症の発症あるいは進行を39%から76%減少させ、同時に低血糖発症率を3倍に増やしたと言う結果であった。この臨床試験によって、糖尿病の長期合併症を回避するためには血糖の厳格な調節が非常に有用であり、インスリン強化療法によってある程度その目標は達成可能であることが示された。だが、このことは同時にインスリン療法では完璧な血糖調節は不可能であり、長期合併症予防にも限界があることを意味した。1型糖尿病は自己免疫の異常によって、インスリンを産生する膵β細胞が特異的に破壊されることで発症する(非特許文献3参照)。その根本的治療には、膵β細胞の再生置換療法のひとつである移植が考えられる。この方法として膵臓移植と膵島移植がある。これら二つの移植の目的は、非常に厳格な血糖調節を可能とし、低血糖さらには長期合併症の発症を回避することである。単にインスリン療法による日常の煩わしさから患者を開放し生活の質(QOL)を向上させる事だけが目的ではない。移植療法はインスリン依存性糖尿病を治癒と言う最終目標に向かわせる手段として、インスリン療法よりは遙かに潜在能力を持った治療法である。しかしながら、現行の膵島移植には大きな問題点がある。移植膵島の不足である。現在の膵島単離技術がいかに向上しようがこれを解決することは不可能である。需要と供給のバランスが違いすぎる。膵島移植が一般的移植医療とはなり得てもそのためのウエイティング・リストは膨大なものとなり、1型糖尿病患者が実際に膵島移植の恩恵を得るには数年から十数年を要すると言う事態になる。すなわち1型糖尿病患者が日常臨床で提示される治療法の選択肢として膵島移植が挙げられることはありえない。



すでに臨床膵島移植で実証された膵島細胞の有効性と移植膵島の絶対的不足と言う2つの現実を前にして、膵島あるいは膵β細胞に匹敵する機能をもつ細胞を作製することは高い社会的貢献と大きな医療経済的影響を有するものである。また、近年急速に進歩し注目を集めている幹細胞研究でも膵内分泌細胞への分化誘導の可能性が示されており(非特許文献4および5参照)、人為的膵β細胞産生に対する関心をさらに助長する要因となっている。



糖尿病の患者数は1型および2型糖尿病ともに増加しており、糖尿病に伴う失明、腎不全および心血管系病変などの重篤な合併症が多発していることからも、急増するであろう当該医療費に対する対策は、高齢化社会をむかえるにあたって、医療上および社会的な緊急課題である。現在臨床で用いられているインスリン投与療法では、たとえ厳格な監視下でも1型糖尿病の血糖コントロール、2型糖尿病の合併症の発症防止は極めて困難である。血糖を感知してそれに対する過不足ない量のインスリンを分泌する細胞を移入することで1型糖尿病を完治できると言う考えが今や世界中で一般的となった。しかしながら、膵臓移植および膵島単離に要する脳死体からの摘出膵はそれを必要とする患者数に対して圧倒的に少なく、今後解消される見込みはない。



そこで、ブタ組織や細胞を利用した研究が進む一方、人畜共通感染症、生体組織適合性や倫理的問題も浮上してきた。とくにウイルスの潜在的危険性が大きな問題となってきた。ブタの臓器や細胞が保有するブタ由来のウイルス(とりわけ、内因性ブタ特異的レトロウイルス(porcine endogenous retrovirus;PERV)は、染色体に組み込まれているために排除は不可能である)がレシピエントに感染して病気を起こす危険性、それが家族や医療スタッフに感染を広げ、さらに社会に新しいウイルス感染を広げる可能性である(非特許文献6参照)。



よって、ヒト成熟膵島β細胞にかわる細胞の供給源として、胚性幹細胞(ES細胞とも言う)や組織幹細胞からのインスリン分泌細胞の分化誘導は魅力的である。よって、これまで多くの研究者によって、当該研究に関する報告がなされている(非特許文献4、7~12参照)。



しかしながら、非特許文献4、7~11に記載された手法はインスリン分泌細胞への分化誘導効率が低く(3%以下である)、かつ分泌されるインスリン量も正常膵島と比較するとmg蛋白あたり1,000分の一と少ない。これは、いずれの手法も未分化なES細胞からインスリン分泌細胞を誘導するための初期分化のために、胚様体形成を最初の工程で行っているためである。胚様体形成を行うことで、分化が誘導されるが、細胞が外胚葉、内胚葉、中胚葉と全ての方向への分化してしまうため、目的とするインスリン分泌細胞は、内胚葉に属するために、他の外胚葉や中胚葉へと分化してくる細胞を淘汰することができないため、最終的な分化誘導率が低く成ってしまうと言う欠点を有する。



一方で、未分化なES細胞を胚様体を形成させることなく胚体内胚葉を形成させ、インスリン分泌細胞へ分化誘導させる手法が報告されている(「ダムール法」と言うこともある)(非特許文献12参照)。胚様体形成を行わないこの手法は、胚様体形成を行う手法と比較して効率よくインスリン分泌細胞を得ることが可能である。しかしながら、非特許文献12に記載された従来技術によるインスリン分泌細胞への分化誘導効率は3-12%とかなり低い効率である。また、該従来技術により得られたインスリン分泌細胞のインスリン分泌量が正常膵島の100分の1から500分の1と低い効率である。これは、ダムール法では処置過程において、膵臓の発生過程でβ細胞への分化を抑制(非特許文献13参照)し、膵外分泌細胞を誘導する(非特許文献14参照)と報告されている線維芽細胞増殖因子-10(FGF-10)を使用していることが要因のひとつである。




【非特許文献1】シャピロ(Shapiro AM)ら,N.Engl.J.Med.,(2000)343,p.230-238.

【非特許文献2】The Diabetes Control and Complications Trial Research Group.N.Engl.J.Med.,(1993)329,p.977-986.

【非特許文献3】アトキンソン(Atkinson MA)ら,N.Engl.J.Med.,(1994)331,p.1428-1436.

【非特許文献4】ルメルスキー(Lumelsky N)ら,Science,(2001),May18;292(5520),p.1389-1394.

【非特許文献5】アッサディ(Assady S)ら,Diabetes,(2001),50,p.1691-1697.

【非特許文献6】ペイシャンス(Patience C)ら,Nat.Med.,(1997),3(3),p.282-286.

【非特許文献7】ホリ(Hori Y)ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,(2002)Dec10;99(25),p.16105-16110.

【非特許文献8】ラジャゴパル(Rajagopal J)ら,Science,(2003)Jan17;299(5605),p.363.

【非特許文献9】シピオネ(Sipione S)ら,Diabetologia,(2004)47(3),p.499-508.

【非特許文献10】ミヤザキ(Miyazaki S)ら,Diabetes.(2004)53(4),p.1030-1037.

【非特許文献11】ハンソン(Hansson M)ら,Diabetes,(2004)53(10),p.2603-2609.

【非特許文献12】ダムール(D’Amour K A)ら,Nat.Biotech.,published online,19 October 2006,doi: 10.1038/nbt1259.

【非特許文献13】ミラレス(Miralles F)ら、Int J Dev Biol. 2006;50(1):17-26.

【非特許文献14】ブシュシャン(Bhushan A)ら、Development. 2001;128(24):5109-17

産業上の利用分野


本発明は、胚性幹細胞(以下、ES細胞とも言う)のインスリン分泌細胞への分化誘導方法および該方法により誘導されるインスリン分泌細胞、ならびに糖尿病治療薬、バイオ人工膵臓、研究試薬および創薬モデル動物に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
胚性幹細胞のインスリン分泌細胞への分化誘導方法であって、
(a)FGF-2およびアクチビンの存在下に胚性幹細胞を培養することにより胚体内胚葉へ分化させる工程、
(b)得られた胚体内胚葉を、FGF-2の存在下、馴化培地を用いて培養することにより原始膵へ分化させる工程であって、該馴化培地がヒト神経膠芽細胞腫由来細胞を細胞培養培地中で培養したものである工程
(c)得られた原始膵を、馴化培地を用いて培養することによりニューロジェニン3発現細胞数を増加させ、ニューロジェニン3発現細胞を得る工程であって、該馴化培地が、ヒト肝内皮細胞を低グルコース細胞培養培地中で培養したものである工程、および
(d)得られたニューロジェニン3発現細胞を、高グルコース濃度の細胞培養用培地中で刺激してインスリン分泌細胞へ分化させる工程
を含む方法。

【請求項2】
アクチビンがアクチビンAである請求項1記載の方法。

【請求項3】
アクチビンの濃度が2~200ng/mLである請求項1または2記載の方法。

【請求項4】
ヒト神経膠芽細胞腫由来細胞が、ヒト神経膠芽細胞腫由来細胞株T98Gである請求項1~のいずれかに記載の方法。

【請求項5】
ヒト肝内皮細胞株が、ヒト肝内皮細胞株TMNK-1(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305-8566)、寄託日:平成14年4月16日、受託番号:FERM BP-8017)である請求項1~のいずれかに記載の方法。

【請求項6】
各工程における培養がそれぞれ、コラーゲンタイプIV、マトリゲル、フィブロネクチン、ジェラチン、ポリオルニチンおよびラミニンよりなる群から選ばれる生体適合性材料を用いる三次元培養である請求項1~のいずれかに記載の方法。

【請求項7】
工程(a)において用いられる生体適合性材料がコラーゲンタイプIVである請求項記載の方法。

【請求項8】
工程(c)において用いられる生体適合性材料がラミニンである請求項または記載の方法。

【請求項9】
工程(a)における細胞培養濃度が1×105~4×105細胞/mLである請求項1~のいずれかに記載の方法。

【請求項10】
工程(b)における細胞培養濃度が1×105~8×105細胞/mLである請求項1~のいずれかに記載の方法。

【請求項11】
工程(a)および/または(b)におけるFGF-2の濃度が2~20ng/mLである請求項1~10のいずれかに記載の方法。

【請求項12】
工程(a)において用いられる培地が、細胞培養用培地中に、ウシ胎仔血清を0.2~3%含有し、ウシ血清アルブミンを2~3%含有する請求項1~11のいずれかに記載の方法。

【請求項13】
工程(b)において用いられる培地が、馴化培地中にレチノイン酸を1~50μmol/L含有する請求項1~12のいずれかに記載の方法。

【請求項14】
工程(c)において用いられる培地が、馴化培地中にγ-セクレターゼ阻害剤XVIIIを0.25~2μmol/L含有し、FGF-2を5~50ng/mL含有し、上皮増殖因子を5~50ng/mL含有する請求項1~13のいずれかに記載の方法。

【請求項15】
工程(c)において、ニューロジェニン3発現細胞がセルソーターを用いて選別される請求項1~14のいずれかに記載の方法。

【請求項16】
工程(d)において用いられる培地が、肝細胞増殖因子を2~50ng/mL含有し、ニコチンアミドを1~10mmol/L含有し、エクセディン-4を5~100nmol/L含有し、トログリタゾン1~10μmol/Lおよび硫酸亜鉛を1~20μmol/L含有する請求項1~15のいずれかに記載の方法。

【請求項17】
工程(d)が、ニューロジェニン3発現細胞を高グルコース濃度の細胞培養用培地、次いで低グルコース濃度の細胞培養用培地中で繰り返し刺激培養する工程からなり、高グルコース濃度の細胞培養用培地中で1回あたり2時間の刺激培養を、1日あたり1~3回行うことを1~10日間繰り返す請求項1~16のいずれかに記載の方法。

【請求項18】
工程(d)において用いられる培地が、高グルコース濃度の細胞培養培地中に脂質、アミノ酸、ビタミンおよび/またはミネラルを含有する請求項1~17のいずれかに記載の方法。

【請求項19】
工程(d)が、さらにニューロジェニン3発現細胞にMafA遺伝子を導入し発現させることにより、インスリン分泌細胞のMafA遺伝子発現を増強させることを含む請求項1~18のいずれかに記載の方法。

【請求項20】
胚性幹細胞が哺乳類由来のものである請求項1~19のいずれかに記載の方法。

【請求項21】
哺乳類がマウス、ヒト、サルよりなる群から選ばれる請求項20記載の方法。

【請求項22】
哺乳類がマウスである請求項21記載の方法。

【請求項23】
請求項1~22のいずれかに記載の方法により誘導されるインスリン分泌細胞。

【請求項24】
インスリン分泌細胞が、スフェロイドを形成しているインスリン分泌細胞を含有する請求項23記載のインスリン分泌細胞。

【請求項25】
請求項23または24記載のインスリン分泌細胞を含有する糖尿病治療剤。

【請求項26】
請求項23または24記載のインスリン分泌細胞を含有するバイオ人工膵臓。

【請求項27】
請求項23または24記載のインスリン分泌細胞を含有する研究試薬。

【請求項28】
請求項23または24記載のインスリン分泌細胞を含有する創薬モデル非ヒト動物。
産業区分
  • 微生物工業
  • 畜産
  • 薬品
  • 治療衛生
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 権利存続中
特許内容に関しての問い合せ窓口は岡山大学連携機構知的財産部門です。

技術移転に関しては岡山TLOが窓口になります。


PAGE TOP

close
close
close
close
close
close
close