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タンパク質産生用およびウイルス増殖用の培地 コモンズ

国内特許コード P110005396
掲載日 2011年8月18日
出願番号 特願2009-507454
登録番号 特許第5634710号
出願日 平成20年3月17日(2008.3.17)
登録日 平成26年10月24日(2014.10.24)
国際出願番号 JP2008054918
国際公開番号 WO2008120570
国際出願日 平成20年3月17日(2008.3.17)
国際公開日 平成20年10月9日(2008.10.9)
優先権データ
  • 特願2007-071390 (2007.3.19) JP
  • 特願2007-238422 (2007.9.13) JP
発明者
  • 難波 ひかる
  • 荒尾 雄二郎
出願人
  • 国立大学法人 岡山大学
発明の名称 タンパク質産生用およびウイルス増殖用の培地 コモンズ
発明の概要 本発明は、動物胞を用いて所望のタンパク質の産生および/または所望のウイルスの増殖させるための細胞培養用培地を提供することを課題とする。さらに、本発明はこれらの培地を用いたタンパク質の産生方法およびウイルスの増殖促進方法を提供することを課題とする。メリビオースなどの糖類を含む培地を用いて動物細胞を培養すると、細胞内に組み込まれた発現プロモーターが活性化されてタンパク質の産生が促進し、または細胞に感染しているウイルスが顕著に増殖する。
従来技術、競合技術の概要



有用なタンパク質を効率的に製造するための生命工学的手法として、目的とするタンパク質をコードするDNAが導入されたベクターを大腸菌や酵母、動物細胞などに導入し、このDNA導入細胞を増殖させた後に細胞や培地中から目的タンパク質を単離精製する方法が知られている。





この方法では、目的タンパク質をコードするDNAを積極的に発現させるために、その上流に発現プロモーターを導入する。かかる発現プロモーターは、遺伝子導入細胞の転写因子群を利用し、その下流に存在する遺伝子の発現を促進する。また、各発現プロモーターの機能を増強するための転写活性化因子も利用されることがある。しかし、有用タンパク質の製造をより一層効率的にするための技術が求められているところである。





また、近年、インフルエンザやエイズなどウイルスを原因とする疾患が問題となっている。そこで、これらウイルスの研究のため、或いはウイルスワクチンの製造などのため、ウイルスの増殖を促進する技術も必要である。しかしウイルス研究においては、ウイルスの増殖効率が悪いことから研究が遅れている分野もある。





ところで、ウイルス感染細胞を含む遺伝子導入細胞を培養するためには、栄養源としての炭素源が必要である。かかる炭素栄養源として、D-グルコースが用いられる場合がほとんどであり、また、その添加量は培地に対して0.1~0.45w/v%である場合が多く、添加量などの条件の検討はほとんど為されていない。これは、当該分野においては目的とするタンパク質をコードする遺伝子に関する研究が多数を占め、培養液は市販のものをそのまま用いる場合が多いことに起因すると考えられる。





それに対して、グルコースなどの糖類により特定の遺伝子の発現を調節する研究も報告されている。例えば非特許文献1には、グルコースが肝臓代謝酵素をコードする遺伝子の転写を調節できるとの記載がある。また、グルコースほどではないが、フルクトースも同様にL-ピルビン酸キナーゼ遺伝子を活性化するとされている。非特許文献2には、グルコースがグルコース自身の代謝に関する遺伝子の発現を促進することが記載されている。非特許文献3には、D-グルコースのみならず、ソルビトールやミオイノシトール、ソルビトールの異性体であるマンニトール等が腎特異的オキシドレダクターゼの発現プロモーターを活性化することが記載されている。





所望のタンパク質をコードするDNAを遺伝子組換えの手法により大腸菌等の宿主細胞へ導入して増殖させ、目的とするタンパク質を製造する技術において、培地へ添加する炭素源としては糖類が知られている。しかし、かかる目的で用いられる糖類は、ほとんどD-グルコースのみであった。また、グルコース等により特定の酵素遺伝子の発現が促進されるという現象も知られていた。しかし、かかる技術で用いられている糖類は、D-グルコースのほかソルビトールやミオイノシトールであり、これら糖類は生体内でD-グルコースの代謝により生合成されるものである。また、かかる技術でその産生が促進される酵素は、糖代謝に関するものばかりである。よって、これら糖類が糖代謝に関する酵素遺伝子を発現させるのは至極当然ではあるが、糖代謝系を持たないウイルスに由来する発現プロモーターを用いる場合やウイルス自身を増殖させる場合には、これらの糖類が当該ウイルスプロモーターを活性化するとは予想し難い。

【非特許文献1】

ASEB J., 8 (1): 28-35 (1994)

【非特許文献2】

. Biol. Chem., 275 (41): 31555-31558 (2000)

【非特許文献3】

he Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102 (50): 17952-17957 (2005)

産業上の利用分野


本発明は、動物細胞を用いて所望のタンパク質の産生および/または所望のウイルスを増殖させるための細胞培養用培地に関する。さらに、本発明はこれらの培地を用いたタンパク質の産生方法およびウイルスの増殖促進方法に関する。



本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2007-71390号および特願2007-238422号優先権を請求する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の工程を含む、動物細胞を用いたタンパク質の産生方法:
1)タンパク質を産生する細胞を人為的に構築する工程:
a)当該タンパク質をコードするDNAと、該DNAを発現させるためのHCMV MIEプロモーター配列を含むDNAを含むベクターを調製する工程;と、
b)当該ベクターを動物細胞に導入する工程。
2)当該構築した細胞を、少なくともマルツロースを含む細胞培養用培地を用いて培養する工程。

【請求項2】
細胞培養用培地に含まれる糖濃度が、1.0~10w/v%である請求項1に記載の産生方法
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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