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insituhybridization法及び自動insituhybridization装置 コモンズ

国内特許コード P110005417
整理番号 646
掲載日 2011年8月18日
出願番号 特願2004-075416
公開番号 特開2005-261235
登録番号 特許第4538627号
出願日 平成16年3月16日(2004.3.16)
公開日 平成17年9月29日(2005.9.29)
登録日 平成22年7月2日(2010.7.2)
発明者
  • 山田 健人
  • 高松 めぐみ
  • 藤本 純一郎
  • 安江 博
  • 近藤 裕道
出願人
  • 学校法人慶應義塾
発明の名称 insituhybridization法及び自動insituhybridization装置 コモンズ
発明の概要

【課題】本発明は、組換えDNA操作を必要とせず、定量性良く発現検出が可能なin situ hybridization法及びそれを自動で行う自動in situ hybridization装置を提供することを目的とする。
【解決手段】試料中で、ハイブリダイゼーション用のプローブを合成する。例えば、試料中で対象となるmRNAを逆転写し、アンチセンスプライマーとRNAポリメラーゼのプロモーターを有するセンスプライマーとを用いてPCRで増幅し、RNAポリメラーゼとdig-UTPを用いて、転写させ、標識アンチセンスcRNAプローブを作製し、mRNAにハイブリダイズさせ、標識を検出することにより、mRNAを検出する。
【選択図】 なし

従来技術、競合技術の概要


遺伝子の発現を検出するための方法として、in situ hybridizationがよく用いられる。In situ hybridizationは、標識を用いてラベルした核酸プローブを、解析目的の遺伝子から転写されたmRNAにハイブリダイズさせることにより、対象となるmRNAを検出するために行われる。



検出のための核酸プローブは、通常in vitroで合成される(例えば、非特許文献1参照)。例えば、標識RNAプローブを合成する場合、RNAポリメラーゼのプロモーターを有する適当なベクターを用いて、目的の配列を有するDNAを、そのプロモーターの下流に挿入し、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチド3リン酸(dig-NTP)を用いたin vitroの転写系で標識プローブを合成する。また、PCRで標識プローブを合成する場合、増幅させる配列をベクターに組み込み、その挿入配列の両側のプライマーを合成し、ジゴキシゲニン標識デオキシヌクレオチド3リン酸(dig-dNTP)を用いてPCRを行うことにより標識プローブを作製することができる。

【非特許文献1】メソッズ(Methods)2001年23巻4号303―312頁

産業上の利用分野


本発明は、遺伝子の発現を解析するためのin situ hybridization法及びそれを自動で行う自動in situ hybridization装置に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
試料中でmRNAを検出するためのin situ hybridization法であって、
前記試料中で、前記mRNAを鋳型にして、RNAポリメラーゼのプロモーター配列及び前記mRNAと相補的な配列を有するプライマー並びに逆転写酵素を用いて逆転写反応を行い、前記mRNAに対するcDNAを得る工程と、
前記試料中で、前記逆転写反応によって得られたcDNAを鋳型にして、前記RNAポリメラーゼのプロモーターから転写させ、前記cDNAに対するcRNAプローブを得る工程と、
前記試料中で、前記cRNAプローブと前記cDNAをハイブリダイズさせる工程と、
ハイブリダイズした前記cRNAプローブを検出する工程と、
を備えることを特徴とするin situ hybridization法。

【請求項2】
試料中でmRNAを検出するためのin situ hybridization法であって、
前記試料中で、前記mRNAを鋳型にして、前記mRNAに相補的な配列を有する第1のプライマー及び逆転写酵素を用いて逆転写反応を行い、前記mRNAに対する第1のcDNAを得る工程と、
前記試料中で、前記第1のcDNAを鋳型にして、RNAポリメラーゼのプロモーター配列及び前記第1のcDNAに相補的な配列を有する第2のプライマー並びにDNAポリメラーゼを用いてDNA合成反応を行い、前記第1のcDNAに相補的な配列を有する第2のcDNAを得る工程と、
前記試料中で、前記第2のcDNAを鋳型にして、前記RNAポリメラーゼのプロモーターから転写させ、cRNAプローブを得る工程と、
前記試料中で、前記cRNAプローブと前記mRNAをハイブリダイズさせる工程と、
ハイブリダイズした前記cRNAプローブを検出する工程と、
を備えることを特徴とするin situ hybridization法。

【請求項3】
試料中でmRNAを検出するためのin situ hybridization法であって、
前記試料中で、前記mRNAを鋳型にして、前記mRNAと相補的な配列を有する第1のプライマー及び逆転写酵素を用いて逆転写反応を行い、前記mRNAに対するcDNAを得る工程と、
前記試料中で、前記cDNAに相補的な配列を有する第2のプライマー、及びRNAポリメラーゼのプロモーター配列と前記cDNAの一部の配列とを有する第3のプライマーを用いて、遺伝子増幅反応により前記cDNAを増幅させる工程と、
前記試料中で、前記遺伝子増幅反応によって得られた前記cDNAを鋳型にして、前記RNAポリメラーゼのプロモーターから転写させ、前記cDNAに対するcRNAプローブを得る工程と、
前記試料中で、前記cRNAプローブと前記cDNAをハイブリダイズさせる工程と、
ハイブリダイズした前記cRNAプローブを検出する工程と、
を備えることを特徴とするin situ hybridization法。

【請求項4】
試料中でmRNAを検出するためのin situ hybridization法であって、
前記試料中で、前記mRNAを鋳型にして、前記mRNAに相補的な配列を有する第1のプライマー及び逆転写酵素を用いて逆転写反応を行い、前記mRNAに対する第1のcDNAを得る工程と、
前記試料中で、RNAポリメラーゼのプロモーター配列と前記第1のcDNAに相補的な配列とを有する第2のプライマー、及び前記mRNAに相補的な配列を有する第3のプライマーを用いて、遺伝子増幅反応により前記第1のcDNAに相補的な配列を有する第2のcDNAを増幅させる工程と、
前記試料中で、前記遺伝子増幅反応によって得られた前記第2のcDNAを鋳型にして、前記RNAポリメラーゼのプロモーターから転写させ、前記第2のcDNAに対するcRNAプローブを得る工程と、
前記試料中で、前記cRNAプローブと前記mRNAをハイブリダイズさせる工程と、
ハイブリダイズしたcRNAプローブを検出する工程と、
を備えることを特徴とするin situ hybridization法。

【請求項5】
前記cDNAを鋳型にして、前記RNAポリメラーゼのプロモーターから転写させるとき、ジゴキシゲニンと結合したヌクレオチド3リン酸を用いることにより、前記cRNAプローブをジゴキシゲニンでラベルし、
ジゴキシゲニンを標識として、前記ハイブリダイズしたcRNAプローブを検出することを特徴とする請求項1または3に記載のin situ hybridization法。

【請求項6】
前記第2のcDNAを鋳型にして、前記RNAポリメラーゼのプロモーターから転写させるとき、ジゴキシゲニンと結合したヌクレオチド3リン酸(dig-NTP)を用いることにより、前記cRNAプローブをジゴキシゲニンでラベルし、
ジゴキシゲニンを標識として、前記ハイブリダイズしたcRNAプローブを検出することを特徴とする請求項2または4に記載のin situ hybridization法。

【請求項7】
前記RNAポリメラーゼのプロモーターが、SP6,T3,T7,及びN4からなる群より選択されることを特徴とする請求項1~6のいずれか1項に記載のin situ hybridization法。

【請求項8】
前記cRNAプローブを検出する工程の前に、
1本鎖特異的RNA分解酵素で処理する工程を行うことを特徴とする請求項1~7のいずれか1項に記載のin situ hybridization法。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
出願権利状態 権利存続中
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