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遺伝子発現検出方法 コモンズ

国内特許コード P110005418
整理番号 645
掲載日 2011年8月18日
出願番号 特願2004-075417
公開番号 特開2005-261236
登録番号 特許第4538628号
出願日 平成16年3月16日(2004.3.16)
公開日 平成17年9月29日(2005.9.29)
登録日 平成22年7月2日(2010.7.2)
発明者
  • 山田 健人
  • 高松 めぐみ
  • 藤本 純一郎
  • 安江 博
  • 近藤 裕道
出願人
  • 学校法人慶應義塾
発明の名称 遺伝子発現検出方法 コモンズ
発明の概要

【課題】本発明は、同一試料に対しin situ hybridization法と免疫染色法の両方を行い、mRNAとタンパク質の両方を検出する同時検出法を行う際に、検出結果を改善するための、各手法における処理方法を提供することを目的とする。
【解決手段】in situ hybridization法においては、蛋白質分解剤としてサーモリジンを用いる。免疫染色法においては、一次抗体反応後、架橋剤を用いて試料を架橋する。同時検出法においては、これらを独立に用いてもよく、両方を用いてもよい。
【選択図】 なし

従来技術、競合技術の概要


遺伝子の発現を検出するための方法として、in situ hybridizationや免疫染色法が知られている。In situ hybridizationは、目的の遺伝子から転写されたmRNAを検出するために、免疫染色法は目的の遺伝子の最終産物であるタンパク質を検出するために行われる。mRNAとタンパク質が同じ遺伝子から由来していても、mRNAの不安定性や、転写後調節などのために、mRNAとタンパク質が異なる分布を示すことも多い。しかし、異なるサンプルを用いて、in situ hybridizationと免疫染色法を独立に行った場合、発現検出領域を細胞レベルで比較することは難しい。そこで、これらの手法を同一のサンプルに対して行えるようにできることが望ましい。



in situ hybridizationでは、標識を用いてラベルした核酸プローブを、対象となるmRNAにハイブリダイズさせることにより、免疫染色法では、対象となるタンパク質に対する抗体を、そのタンパク質に結合させることによって、mRNA及びタンパク質をそれぞれ検出する。したがって、これら二つの手法は全く異なるため、これらの手法を同一のサンプルに対して行うには、それぞれの手法に対する一連の処理を同時に行うことは難しく、順次行う必要がある。(例えば、非特許文献1参照)
これらの手法を順次同一のサンプルに対して行う時、in situ hybridizationでは、プローブをジコキシゲニン(digoxygenin、DIGと略される)で、免疫染色法では、抗体をアルカリホスファターゼやHRPなどの酵素でラベルすることが多いが、両方とも最終段階でのシグナルの検出に酵素活性を用いた発色反応を行う。しかし、どちらの発色反応によるものであっても、サンプルを一旦発色させると、プローブや抗体の浸透が阻害されるため、プローブのハイブリダイゼーションや一次抗体の結合の段階で先に行う手法をいったん中止し、それから後に行う手法を行った後で、最終段階で同時に発色を行うのが通常である。

【非特許文献1】カレント・トピックス・マイクロバイオロジカル・イミュノロジー(Curr. Top. Microbiol. Immuno.) 1989年143巻9-20頁

産業上の利用分野


本発明は、遺伝子の発現を解析するための遺伝子発現検出方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
サーモリジンを含有する、in situ hybridization法で用いるためのタンパク質分解剤。

【請求項2】
タンパク質分解剤としてサーモリジンを用いることを特徴とするin situ hybridization法。

【請求項3】
試料を固定する工程と、
固定した試料に対し、サーモリジンを用いて、タンパク質分解処理を行う工程と、
標識を用いてラベルした核酸プローブを、検出対象のmRNAにハイブリダイズさせる工程と、
前記標識を検出する工程と、
を備えるin situ hybridization法。

【請求項4】
前記試料が組織切片であることを特徴とする請求項3に記載のin situ hybridization法。

【請求項5】
前記試料がホールマウントの個体であることを特徴とする請求項3に記載のin situ hybridization法。

【請求項6】
同一試料に対しin situ hybridization法と免疫染色法の両方を行い、mRNAとタンパク質の両方を検出するための同時検出法であって、
タンパク質分解剤としてサーモリジンを用いることを特徴とする同時検出法。

【請求項7】
同一試料に対しin situ hybridization法と免疫染色法の両方を行い、mRNAとタンパク質の両方を検出するための同時検出法であって、
試料を固定する工程と、
固定した試料に対し、サーモリジンを用いて、タンパク質分解処理を行う工程と、
第1の標識を用いてラベルした核酸プローブを、検出対象のmRNAにハイブリダイズさせる工程と、
前記ハイブリダイズさせた試料に対し、検出対象のタンパク質に、一次抗体を結合させる工程と、
前記一次抗体に、第2の標識を用いてラベルした二次抗体を結合させる工程と、
前記第1および第2の標識を検出する工程と、
を備える同時検出法。

【請求項8】
タンパク質分解剤としてサーモリジンを含有する、in situ hybridization用キット。
産業区分
  • 微生物工業
  • 治療衛生
  • 試験、検査
国際特許分類(IPC)
出願権利状態 権利存続中
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