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フラップエンドヌクレーゼ活性増強因子

国内特許コード P110005966
整理番号 QP060004
掲載日 2011年11月28日
出願番号 特願2006-328160
公開番号 特開2008-136446
登録番号 特許第5030265号
出願日 平成18年12月5日(2006.12.5)
公開日 平成20年6月19日(2008.6.19)
登録日 平成24年7月6日(2012.7.6)
発明者
  • 堀江 祐範
  • 謝 敏▲玉▼
  • 福井 孝一
  • 景山 義隆
  • 松本 和子
  • 石野 良純
出願人
  • 国立大学法人九州大学
発明の名称 フラップエンドヌクレーゼ活性増強因子
発明の概要 【課題】Aeropyrum pernix由来のフラップエンドヌクレアーゼの酵素活性の増強に有用な蛋白質を提供する。
【解決手段】Aeropyrum pernix由来の特定のアミノ酸配列からなる蛋白質よりなるヘテロ3量体蛋白質。該ヘテロ3量体蛋白質は、A. aeropyrum由来のフラップエンドヌクレアーゼだけでなく、他の微生物由来のフラップエンドヌクレアーゼの酵素活性も増強する機能を有している。また、該ヘテロ3量体の存在下でフラップエンドヌクレアーゼを作用させ、一塩基多形のタイピングを行う。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要 遺伝子多形、特に一塩基多形(single nucleotidepolymorphism、SNP)は、遺伝暗号である核酸の塩基配列の個人間における一遺伝暗号の違いを意味する。かかる塩基配列の違いが、疾患へのかかりやすさ(疾患易罹患性)や薬物作用の程度を決定する要因の一つとなり得ることから、このSNPの有無とその判定方法は、多くの関心を集めている技術である。

このSNPの有無の判別方法、いわゆるSNPのタイピング法に、「インベーダー法」と呼ばれる方法がある。この方法の原理は非特許文献1に詳しく説明されているが、要すれば、SNPの存在が想定される塩基を境に、その3’末端側で鋳型DNAとハイブリダイズすることのできる塩基配列を有し、かつその5’末端側で鋳型DNAとはハイブリダイズしない塩基配列を有するアレルプローブと、SNPの存在が想定される塩基を3’末端としてその上流側の配列とハイブリダイズすることのできる塩基配列を有するインベーダープローブを用意し、これらを鋳型DNAにハイブリダイズさせた後、アレルプローブのハイブリしていない5’末端部分をエンドヌクレアーゼで切断し、このとき生じるDNA断片を基にして、SNPの存在を確認する方法である。

このインベーダー法で使用されるエンドヌクレアーゼは、別名フラップエンドヌクレアーゼ(Flap EndoNuclease、FEN)と呼ばれている。FENは、二本鎖DNA上で相補的結合を形成せずに存在している部分(フラップ)を、相補的結合をしている塩基の5’末端側で切断して遊離させるが、その特異性は切断されるDNAの塩基配列には依存しないという特徴を有する、エンドヌクレアーゼの一種である。

実用化され、広く利用されているインベーダー法では、cleavaseと呼ばれるArchaeoglobus fulgidus由来の酵素(非文献特許2)がFENとして利用されることが多いが、このcleavaseの他にも、微生物由来のFENが幾つか報告されている。その一つに、超好熱性古細菌の一種のアエロピルム属細菌 であるAeropyrum pernix(A.pernix)由来のFENがある(AP-FEN、非特許文献3)。

しかし、このAP-FENは、cleavaseと比較してDNAフラップを切断する活性(フラップ切断活性)が低いことなどから、AP-FENを用いたインベーダー法は実用化されるまでには至っていない。
【非特許文献1】中村祐輔編、SNP-遺伝子多形の戦略、2001年、第4刷、中山書店、東京。
【非特許文献2】Cookseyら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy、2000年、第 44巻、第5号、第1296~1301頁
【非特許文献3】Collinsら、Acta Crystallograhica sectionD, Biological Crystallography. 2004年、第60巻、第1674~1678頁

産業上の利用分野 本発明は一塩基遺伝子多刑(SNP)のタイピングに利用されるフラップエンドヌクレアーゼの活性を増強する因子とその利用に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、及び配列番号3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなるヘテロ3量体蛋白質の存在下でフラップエンドヌクレアーゼを作用させる、一塩基多形のタイピング方法。

【請求項2】
配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質、及び配列番号3で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質からなり、かつフラップエンドヌクレアーゼ活性を増強する活性を有するヘテロ3量体蛋白質の存在下で、フラップエンドヌクレアーゼを作用させる、一塩基多形のタイピング方法

【請求項3】
フラップエンドヌクレアーゼがアエロピラム(Aeropyrum)属細菌もしくはスルホロバス(Sulfolobus)属細菌由来のフラップエンドヌクレアーゼである、請求項1又は2に記載の一塩基多形のタイピング方法。

【請求項4】
配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、及び配列番号3で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質からなるヘテロ3量体蛋白質及びフラップエンドヌクレアーゼを含む、一塩基多形のタイピング用キット。

【請求項5】
配列番号1で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質、及び配列番号3で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異体蛋白質からなり、かつフラップエンドヌクレアーゼ活性を増強する活性を有するヘテロ3量体蛋白質及びフラップエンドヌクレアーゼを含む、一塩基多形のタイピング用キット。

【請求項6】
フラップエンドヌクレアーゼがアエロピラム(Aeropyrum)属細菌もしくはスルホロバス(Sulfolobus)属細菌由来のフラップエンドヌクレアーゼである、請求項4又は5に記載の一塩基多形のタイピング用キット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
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