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SalmonellaTyphimuriumを検出するためのオリゴヌクレオチドとそれらを用いた血清型迅速同定法

国内特許コード P110006376
掲載日 2011年12月27日
出願番号 特願2011-175338
公開番号 特開2011-234739
登録番号 特許第5279051号
出願日 平成23年8月10日(2011.8.10)
公開日 平成23年11月24日(2011.11.24)
登録日 平成25年5月31日(2013.5.31)
発明者
  • 秋庭 正人
  • 楠本 正博
  • 岩田 剛敏
出願人
  • 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 SalmonellaTyphimuriumを検出するためのオリゴヌクレオチドとそれらを用いた血清型迅速同定法
発明の概要

【課題】サルモネラを検出するためのオリゴヌクレオチドとそれらを用いた血清型迅速同定法を提供することを課題とする。
【解決手段】in silicoでの比較ゲノム解析により血清型ST、SH、SIの3血清型に特異性の高い遺伝子を、それぞれ3つ選び出した。これらの遺伝子とサルモネラ属特異的であることが公知であるinvAの4遺伝子を同時に検出するマルチプレックスPCRの系を確立した。上記3血清型同定法としてのマルチプレックスPCR法の特異性を、野外分離株を用いて検証したところ、当該血清型であれば3つの血清型特異的遺伝子全てが増幅されるが、他の血清型で3遺伝子陽性となる例は一部の例外を除いて認められなかった。即ち、構築したプライマーを用いたマルチプレックスPCRにより、これら3血清型を短時間で同定することが可能となった。
【選択図】なし

従来技術、競合技術の概要


サルモネラ感染は家畜生産の阻害要因であるのみならず、畜産物を介してヒトに食中毒を起こすことから、公衆衛生上の脅威ともなっている。サルモネラは飼料を介して家畜に伝播するため、飼料安全法で有害微生物と規定されている。このため、農林水産消費安全技術センター・肥飼料安全検査部では飼料のサルモネラ汚染のモニタリング調査を継続的に実施している。分離されたサルモネラが、家畜伝染病予防法で「家畜伝染病」または「届出伝染病」と規定される主要6血清型(Gallinarum、Typhimurium、Dublin、Enteritidis、Choleraesuis、Abortusequi)であるか否かでその後の対応が異なるため、血清型の特定が必須であるが、現行のサルモネラ血清型別法では判定までに約2週間を必要とする。このため、飼料から上記6血清型のサルモネラが検出されても、その判定結果が出るまでに当該飼料が消費されてしまう可能性が高い。また、2004年にと畜場法が改正され、監視伝染病に含まれる病原体が分離された場合、枝肉を全廃棄することが明記された。このため、食肉衛生検査所では、肉眼病変の認められた材料について上記6血清型が分離されるか否かを検査する必要性が生じた。検査結果が出るまでに約2週間を必要とし、この間、枝肉を保留する必要があるため、公衆衛生上大きな問題となっている。以上のことから、飼料検査及び食肉衛生検査の現場で、主要なサルモネラ血清型の迅速同定法開発が強く求められている。人や家畜から分離される主要なサルモネラ血清型の迅速同定法が実用化されれば、家畜保健衛生所における日常検査、血清型別不能菌の同定、スクリーニング検査等へも応用可能であり、畜産物の安全・安心を確保する上で極めて有効なツールとなる。

産業上の利用分野


本発明は、血清型特異的遺伝子の多重検出によるサルモネラ血清型の迅速同定法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下(a)に記載のPCR産物の種類、及び、以下(b)に記載のPCR産物の種類を比較する工程を含む被検サルモネラの血清型を同定する方法であって、前記工程において比較したPCR産物の種類が一致したときに、被検サルモネラの血清型がSTであると判定される方法;
(a)血清型がSTである対照サルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、少なくとも下記(i)又は(ii)に記載のセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物の種類であって、対照サルモネラに特異的なPCR産物の種類、及び
(b)被検サルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、(a)と同じセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物の種類;
(i)下記(1)から(3)に記載のセット
(1)配列番号:3に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:4に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:5に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:6に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:7に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:8に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(ii)下記(1)から(4)に記載のセット
(1)配列番号:1に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:3に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:4に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:5に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:6に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:7に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:8に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。

【請求項2】
PCRがマルチプレックスPCRである、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
以下(2)から(4)に記載の3組のセット
(2)配列番号:3に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:4に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:5に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:6に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:7に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:8に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット

【請求項4】
以下(1)から(4)に記載の4組のセット
(1)配列番号:1に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:3に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:4に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:5に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:6に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドセット、
(4)配列番号:7に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:8に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット

【請求項5】
請求項3またはに記載のセットを含むサルモネラの血清型判別用キット。

【請求項6】
血清型STのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、請求項3または請求項4に記載されるセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるDNA断片。

【請求項7】
PCRがマルチプレックスPCRである、請求項に記載のDNA断片。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 権利存続中


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