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新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法

国内特許コード P120006573
整理番号 K022P51
掲載日 2012年1月30日
出願番号 特願2010-525700
登録番号 特許第5357883号
出願日 平成21年8月19日(2009.8.19)
登録日 平成25年9月6日(2013.9.6)
国際出願番号 JP2009064522
国際公開番号 WO2010021344
国際出願日 平成21年8月19日(2009.8.19)
国際公開日 平成22年2月25日(2010.2.25)
優先権データ
  • 特願2008-214016 (2008.8.22) JP
発明者
  • ▲桑▼原 正靖
  • 小比賀 聡
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法
発明の概要 本発明のヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法は、少なくとも3つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、2’,4’-架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程を含む。本発明の方法に用いられる2’,4’-架橋型ヌクレオシド三リン酸としては、例えば、5-メチル-2’-O,4’-C-(メチレンオキシメチレン)ウリジン-5’-三リン酸、5-メチル-2’-O,4’-C-(アミノメチレン)ウリジン-5’-三リン酸、および5-メチル-2’-O,4’-C-(ベンジルオキシメチレン)ウリジン-5’-三リン酸が挙げられる。本発明の方法によれば、既存の機能性核酸に対して、後から簡単に優れたヌクレアーゼ耐性を付与することができる。
従来技術、競合技術の概要


核酸分子は、分子生物学や化学生物学などの種々の分野で使用され、医薬・診断薬への応用も盛んに検討されている。核酸分子をインビボで使用する場合、ヌクレアーゼ(核酸分解酵素)耐性を考慮しなくてはならない。そのため、インビトロで機能を十分に果たすという治験が得られた核酸分子であっても、改めて分子設計を行って、その核酸分子に耐性を付与しなければならない。



これまでの研究で、架橋型ヌクレオチドを機能性核酸(アンチセンス、アプタマーなど)に導入することによって、ヌクレアーゼ耐性が向上することが知られている。例えば、二環系の糖部分を有するロックト核酸(Locked Nucleic Acid:LNA)が化学合成され、このLNAを有するオリゴヌクレオチドは、天然型のオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼへの耐性が向上しており、したがって体内での安定性が改善される可能性が示唆されている(非特許文献1)。さらに、ヌクレアーゼ耐性を付与することが可能な架橋型核酸(Bridged Nucleic Acid)が、種々設計および合成されている(非特許文献2~4)。また、このような架橋型ヌクレオチドの三リン酸アナログを含むプライマーについて、DNAポリメラーゼに対する影響が検討されており、糖部分の改変が、ポリメラーゼ反応に大きく影響を及ぼすことが報告されている(非特許文献5)。



しかし、これらの架橋型ヌクレオチドおよびそのアナログを核酸(オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド)中に付与または導入するためには、いずれも化学合成により(例えば、自動化DNA合成機を用いて)作成する必要がある。そのため、配列未知のDNA鎖や100残基を超える長い塩基長のDNA鎖について、従来法でヌクレアーゼ耐性を付与することは、非常に手間がかかる。



上記架橋型ヌクレオチドであるLNAについては、末端デオキシヌクレオチド転移酵素(TdT)によって認識され、DNAオリゴヌクレオチドに組込まれること、およびそれによってDNAオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性が付与されることが知られている(特許文献1)。

産業上の利用分野


本発明は、新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法に関する。より詳細には、既存の機能性核酸に対して、後からヌクレアーゼ耐性を付与するための方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
ヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法であって、
少なくとも3つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、2’,4’-架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程を含み、
該2’,4’-架橋型ヌクレオシド三リン酸が、以下の式IIまたは式III:
【化1】


【化2】


(式中、
Baseは、2,4-ジヒドロキシ-5-メチルピリミジン-1-イル基であり;
Rは、水素原子であり;
およびRのいずれか一方は水素原子であり、他方はフェニル基であり;そして
nは、1である)
で表される構造を有する、方法。

【請求項2】
末端デオキシヌクレオチド転移酵素、および2’,4’-架橋型ヌクレオシド三リン酸を含む、ヌクレアーゼ耐性核酸の調製用キットであって、
該2’,4’-架橋型ヌクレオシド三リン酸が、以下の式IIまたは式III:
【化3】


【化4】


(式中、
Baseは、2,4-ジヒドロキシ-5-メチルピリミジン-1-イル基であり;
Rは、水素原子であり;
およびRのいずれか一方は水素原子であり、他方はフェニル基であり;そして
nは、1である)
で表される構造を有する、キット。

【請求項3】
以下の式II’または式III’で表される2’,4’-架橋型ヌクレオチド:
【化5】


【化6】


(式中、
Baseは、2,4-ジヒドロキシ-5-メチルピリミジン-1-イル基であり;
Rは、水素原子であり;
およびRのいずれか一方は水素原子であり、他方はフェニル基であり;
そして
nは、1である)
を3’末端に有する、ヌクレアーゼ耐性核酸。

【請求項4】
請求項1に記載の方法により調製された、ヌクレアーゼ耐性核酸。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
参考情報 (研究プロジェクト等) さきがけ 構造機能と計測分析 領域
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