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ウイルス感染細胞の検出・同定法及びキット 外国出願あり

国内特許コード P120006631
整理番号 NU-0250
掲載日 2012年2月14日
出願番号 特願2010-503771
登録番号 特許第5429679号
出願日 平成21年3月17日(2009.3.17)
登録日 平成25年12月13日(2013.12.13)
国際出願番号 JP2009001173
国際公開番号 WO2009116266
国際出願日 平成21年3月17日(2009.3.17)
国際公開日 平成21年9月24日(2009.9.24)
優先権データ
  • 特願2008-073384 (2008.3.21) JP
発明者
  • 木村 宏
  • 西山 幸廣
出願人
  • 国立大学法人名古屋大学
発明の名称 ウイルス感染細胞の検出・同定法及びキット 外国出願あり
発明の概要 浮遊細胞系において、ウイルス感染細胞を簡便な操作で特異的且つ高感度に検出且つ同定する手段を提供することを課題とする。(1)標的細胞特異的な細胞表面抗原に対する、第1標識物質で標識された第1標識抗体を検体に添加し、反応させるステップ;(2)RNA安定化剤の存在下、タンパク質を固定化するステップ;(3)界面活性剤で処理するステップ;(4)標的ウイルスに特異的な核酸に対する標識核酸プローブを添加し、ハイブリダイゼーションさせるステップを行った後、(5)フローサイトメトリーによって、第1標識抗体と標識核酸プローブの両方で標識された細胞を検出することにより、ウイルス感染細胞を検出・同定する。
従来技術、競合技術の概要



エプスタイン・バール・ウイルス(Epstein-Barr virus:EBV)は日和見リンパ腫、悪性リンパ腫、白血病などの原因となる。EBVは、感染細胞核内でウイルス特異的なmRNAであるEBV encoded small RNA1 (EBER-1)を発現している。病理組織ではin situハイブリダイゼーション(ISH)法を用いたEBER-1の検出と表面抗原染色によるEBV感染細胞同定法が確立されている。しかし、EBV感染細胞が少ない血液・浮遊細胞系では感染細胞の同定は困難であり、診断に難渋することが多い。

ペプチド核酸(Peptide nucleic acid:PNA)はグリシン骨格が塩基に共有結合した構造をとり、DNA・RNAより安定であり且つ核酸にハイブリダイズできる。このPNAを蛍光標識してプローブとして用い、フローサイトメトリー(FCM)でEBV感染細胞を検出する技術が報告されている(非特許文献1)。このPNAプローブは病理組織診断キットとして市販されており、現在では臨床にて広く用いられている(Epstein-Barr Virus (EBER) PNA Probe/Fluorescein、Code No. Y5200、Dako社)。EBV特異的PNAプローブを用いた上記キットは、スライドに固定した病理組織に用いるために開発されたものであり、血液や浮遊細胞を検体とした検出・診断に適したものではない。また、そのような使用は予定されていない。

【非特許文献1】

. Just et al., J Virol Methods 73(1998) 163-174

産業上の利用分野



本発明は、ウイルス感染細胞を検出・同定する方法及び当該方法用のキットに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下のステップ(1)~(5)、即ち、
(1)標的細胞特異的な細胞表面抗原に対する、第1標識物質で標識された第1標識抗体を検体に添加し、反応させるステップ;
(2)酢酸の存在下、タンパク質を固定化するステップ;
(3)界面活性剤で処理するステップ;
(4)標的ウイルスに特異的な核酸に対する標識核酸プローブを添加し、ハイブリダイゼーションさせるステップ;
(4-1)標識核酸プローブの標識部分に対する、第2標識物質で標識された第2標識抗体を添加し、反応させるステップ;
(4-2)第2標識抗体に対する、第2標識物質と同一の第3標識物質で標識された第3標識抗体を添加し、反応させるステップ;
(5)フローサイトメトリーによって、第1標識抗体と第2標識物質の両方で標識された細胞を検出するステップ、
を含む、ウイルス感染細胞を検出及び同定する方法であって、
ステップ(2)を、酢酸濃度が0.5 %(v/v)~2.0 %(v/v)の条件下で実施し、
ステップ(4)を、ホルムアミド濃度が15 %(v/v)~25 %(v/v)の条件下で実施する、方法

【請求項2】
ステップ(2)における酢酸濃度が1%(v/v)である、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
ステップ(4)におけるホルムアミド濃度が20%(v/v)である、請求項1又は2に記載の方法

【請求項4】
標的ウイルスがエプスタイン・バール・ウイルスである、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】
標的ウイルスに特異的な核酸が、エプスタイン・バール・ウイルスがコードする小RNA(EBER)である、請求項に記載の方法。

【請求項6】
標的細胞がB細胞、T細胞又はNK細胞である、請求項1~のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】
検体が血液検体である、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】
ステップ(2)における固定化剤としてパラホルムアルデヒドを用いる、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】
界面活性剤が非イオン系界面活性剤である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】
標識核酸プローブが標識ペプチド核酸(PNA)である、請求項1~のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】
第2標識物質がAlexa Fluor(登録商標)488、Oregon Green(登録商標)-488、Rhodamine-123、Cy2、CYBR(登録商標) Green I、及びEGFPからなる群より選択される蛍光色素であ、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】
請求項1~11のいずれか一項に記載の方法に使用されるキットであって、標的細胞特異的な細胞表面抗原に対する、第1標識物質で標識された第1標識抗体と、
エプスタイン・バール・ウイルスに特異的な核酸に対する標識核酸プローブと、
標識核酸プローブの標識部分に対する、第2標識物質で標識された第2標識抗体と、
第2標識抗体に対する、第2標識物質と同一の第3標識物質で標識された第3標識抗体と、
を含む、エプスタイン・バール・ウイルス感染細胞の検出及び同定用キット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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