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新規な部位特異的組換え酵素とその認識配列を用いた部位特異的組換え方法 実績あり 外国出願あり

国内特許コード P120007120
整理番号 128
掲載日 2012年3月29日
出願番号 特願2011-518529
登録番号 特許第5336592号
出願日 平成22年6月7日(2010.6.7)
登録日 平成25年8月9日(2013.8.9)
国際出願番号 JP2010059620
国際公開番号 WO2010143606
国際出願日 平成22年6月7日(2010.6.7)
国際公開日 平成22年12月16日(2010.12.16)
優先権データ
  • 特願2009-136830 (2009.6.8) JP
  • 特願2009-248439 (2009.10.29) JP
発明者
  • 中山 学
出願人
  • 公益財団法人かずさDNA研究所
発明の名称 新規な部位特異的組換え酵素とその認識配列を用いた部位特異的組換え方法 実績あり 外国出願あり
発明の概要

以下のポリペプチドから成る部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチド:
(1)配列番号2又は配列番号8に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド;
(2)配列番号2又は配列番号8に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、(1)のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド;又は、
(3)配列番号2又は配列番号8に示されるアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、(1)のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド;又は、
(4)配列番号2又は配列番号8に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体によって認識されるポリペプチドであって、(1)のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド。

従来技術、競合技術の概要


部位特異的組換えとは、数百塩基対にも及ぶ長い塩基配列によって起こる相同的組換えとは異なり、特定の短い相同的な塩基配列によってDNAが組換えをする現象である。



部位特異的組換え酵素による部位特異的組換えとしては、ファージ由来のCre/loxP系が有名で、大腸菌からマウスまで広く使用されている。



Cre酵素はP1ファージ由来の343個のアミノ酸から成る蛋白質でloxP部位と呼ばれる34bpの特異的な塩基配列を認識し、部位特異的組換えを行うことができる。Cre/loxPの特異的組み換えシステムに関しては多くの知見が蓄積されている(特許文献1及び特許文献2)。loxP部位は13塩基、8塩基、及び13塩基の3つの部分に分けることができ、13塩基の配列は相補的なインバーテッドリピート構造となっている一方、8塩基はloxP部位の向きを決める役割を果たす。Lox511やlox2272と呼ばれる変異型のloxPも多く報告されており、変異型のloxP部位を含めて2個のloxPにはさまれたDNA領域の欠損や置換、逆向きにする等の染色体DNA上の遺伝子構造の改変に幅広く利用されている。



更に、部位特異的組換え酵素による部位特異的組換えシステムの他の例として、酵母プラスミド2μ由来のFlp/FRT系(非特許文献1)及び腸内細菌ファージD6由来のDre/rox系(特許文献3)を挙げることが出来る。



このような部位特異的組換えシステムにおいて、部位特異的組換え酵素を組織特異的、細胞特異的、発現時期特異的、又は誘導型等の各種のプロモーターの制御下で発現させることによって、様々な条件付きノックアウト又はノックイン実験動物を作製することが可能である。

産業上の利用分野


本発明は、新規な部位特異的組換え酵素とその認識配列を用いた部位特異的組換え方法等に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下のポリペプチド:
(1)配列番号2に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド;
(2)配列番号2に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、(1)のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド;又は、
(3)配列番号2に示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、(1)のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド、
から成る部位特異的組換え酵素によって認識される配列であって、配列番号3~5、又は13~15のいずれかに示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。

【請求項2】
請求項1記載の2つのオリゴヌクレオチドの間に標的DNA領域を含むベクター。

【請求項3】
請求項2記載のベクターによって形質転換された細胞。

【請求項4】
幹細胞である、請求項3記載の細胞。

【請求項5】
染色体の標的DNA領域を挟むように請求項1記載の2つのオリゴヌクレオチドが導入された、ヒト以外のターゲッティング動物。

【請求項6】
齧歯類である、請求項5記載のターゲッティング動物。

【請求項7】
請求項5又は6記載のターゲッティング動物、及び、請求項1記載の部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチドが染色体に導入されたヒト以外のトランスジェニック動物の交配によって作製された条件付ノックイン又はノックアウト実験動物。

【請求項8】
齧歯類である、請求項7記載の条件付ノックイン又はノックアウト実験動物。

【請求項9】
標的DNA領域を含むヌクレオチド配列における部位特異的組換え方法であって、
(1)標的DNA領域を挟むように請求項1記載の塩基配列からなる2つのオリゴヌクレオチドを該ヌクレオチド配列に導入し、
(2)該標的DNA領域を請求項1記載の部位特異的組換え酵素と接触させて、該オリゴヌクレオチド部位において部位特異的組換えを生起させる、ことから成る前記方法。

【請求項10】
請求項2記載のベクターが導入された形質転換細胞において生起する、請求項9記載の部位特異的組換え方法。

【請求項11】
請求項7又は8記載の条件付ノックイン又はノックアウト実験動物において行なわれる、請求項10記載の部位特異的組換え方法。

【請求項12】
標的DNA領域が蛋白質又はその一部をコードする、請求項9ないし11のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法。

【請求項13】
部位特異的な標的DNA領域の欠損、置換、又は逆向きが起こる、請求項9ないし12のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法。

【請求項14】
請求項9ないし13のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法を行なうための部位特異的組換え用キットであって、
(1)請求項1記載の部位特異的組換え酵素又は該酵素をコードするポリヌクレオチド、及び
(2)請求項1記載のオリゴヌクレオチド、を含む該キット。
産業区分
  • 微生物工業
  • 畜産
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 権利存続中
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