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三次元細胞培養体の生体シグナルの検出方法及び検出キット

国内特許コード P120007325
整理番号 K028P44
掲載日 2012年4月17日
出願番号 特願2010-537775
登録番号 特許第5130376号
出願日 平成21年11月10日(2009.11.10)
登録日 平成24年11月9日(2012.11.9)
国際出願番号 JP2009069124
国際公開番号 WO2010055829
国際出願日 平成21年11月10日(2009.11.10)
国際公開日 平成22年5月20日(2010.5.20)
優先権データ
  • 特願2008-289011 (2008.11.11) JP
発明者
  • 松崎 典弥
  • 明石 満
  • 岡野 和宣
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 三次元細胞培養体の生体シグナルの検出方法及び検出キット
発明の概要 三次元細胞培養体の生体シグナルを検出する方法を提供する。積層された少なくとも2層の細胞層と、生体シグナルを検出可能なセンサー粒子とを含む三次元細胞培養体を準備すること、及び、センサー粒子を光学的に観察することを含む三次元細胞培養体の生体シグナルの検出方法である。三次元細胞培養体は、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGDを有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子の組み合わせを含む細胞外マトリックスを含む三次元細胞培養体であることが好ましい。
従来技術、競合技術の概要


細胞は、多様な機能を発揮し、生体として正常に機能するために情報を伝達する機能を有する。



細胞の状態、細胞が産出するシグナル、薬物等に対する細胞の応答等を観察する技術としては、例えば、細胞に何らかの刺激を与えた後、細胞からDNAやタンパク質を抽出して解析する技術、細胞が産出する物質や、細胞表面や内部に存在する物質を、蛍光化合物等を用いて測定する技術(特許文献1)、及び、電極等が配置された細胞培養マイクロアレイ上で細胞を培養しながら、光学的又は電気化学的に細胞の形状観察や細胞電位の変化を計測する技術(特許文献2)等がある。



一方、細胞を三次元に積層する技術としては、細胞外マトリックス形成と細胞層形成とを交互に繰り返して三次元積層体を形成する技術(特許文献3、非特許文献1及び2)、予めシート状に培養した二次元培養細胞シートを積層する細胞シート技術(非特許文献3)、キトサン薄膜を使用して細胞を積層する技術(非特許文献4)、及び、細胞と細胞外マトリックスを含むマイクロ流体を流路に流し込んで積層する技術(非特許文献5)等がある。

産業上の利用分野


本発明は、三次元細胞培養体の生体シグナルの検出方法及びそれに用いる検出キットに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
積層された少なくとも2層の細胞層と、細胞外マトリックスと、生体シグナルを検出可能なセンサー粒子とを含む三次元細胞培養体を準備すること、及び、
前記センサー粒子を光学的に観察することを含み、
前記細胞外マトリックスは、少なくとも前記細胞層間に形成され、
前記センサー粒子は、前記細胞層間の細胞外マトリックスに配置されている、三次元細胞培養体の生体シグナルの検出方法。

【請求項2】
前記センサー粒子は、センサー機能を有する物質と、センサー機能を有する物質を担持する担持体と、前記担持体の表面に交互に積層された生体適合性を有する塩基性ポリマー層及び生体適合性を有する酸性ポリマー層とを含み、前記担持体が多孔性粒子である、請求項1記載の検出方法。

【請求項3】
前記センサー粒子の光学的な観察は、前記生体シグナルを可視化及び/又は数値化することを含む、請求項1記載の検出方法。

【請求項4】
前記細胞外マトリックスは、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGDを有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子の組み合わせを含む、請求項1から3のいずれかに記載の検出方法。

【請求項5】
前記三次元細胞培養体は、細胞含有溶液を配置して細胞層を形成すること、第1液と第2液とを交互に配置して細胞外マトリックスを形成すること、前記細胞外マトリックスの形成及び前記細胞層の形成を交互に行うことにより前記細胞層を積層すること、及び、細胞層間に前記生体シグナルを検出可能なセンサー粒子を配置することを含む製法により製造されうるものであって、
前記第1液の含有物と第2液の含有物との組み合わせが、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGDを有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子の組み合わせである、請求項1からのいずれかに記載の検出方法。

【請求項6】
前記センサー粒子は、センサー機能を有する物質と、センサー機能を有する物質を担持する担持体と、前記担持体の表面に交互に積層された塩基性ポリマー層及び酸性ポリマー層とを含む、請求項1記載の検出方法。

【請求項7】
請求項1からのいずれかに記載の検出方法に用いる検出キットであって、
積層された少なくとも2層の細胞層と、少なくとも前記細胞層間に形成された細胞外マトリックスと、前記細胞層間に形成された細胞外マトリックスに配置された生体シグナルを検出可能なセンサー粒子とを含む三次元細胞培養体を有する、検出キット。

【請求項8】
前記三次元細胞培養体は、細胞含有溶液を配置して細胞層を形成すること、第1液と第2液とを交互に配置して細胞外マトリックスを形成すること、前記細胞外マトリックスの形成及び前記細胞層の形成を交互に行うことにより前記細胞層を積層すること、及び、細胞層間に前記生体シグナルを検出可能なセンサー粒子を配置することを含む製法により製造されうるものであって、
前記第1液の含有物と第2液の含有物との組み合わせが、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGDを有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子の組み合わせである、請求項記載の検出キット。

【請求項9】
前記センサー粒子は、センサー機能を有する物質と、センサー機能を有する物質を担持する担持体と、前記担持体の表面に交互に積層された生体適合性を有する塩基性ポリマー層及び生体適合性を有する酸性ポリマー層とを含む、請求項又はに記載の検出キット。

【請求項10】
細胞含有溶液を配置して細胞層を形成すること、
第1液と第2液とを交互に配置して細胞外マトリックスを形成すること、
前記細胞外マトリックスの形成及び前記細胞層の形成を交互に行うことにより前記細胞層を積層すること、及び、
細胞層間に、生体シグナルを検出可能なセンサー粒子を配置することを含み、
前記第1液の含有物と第2液の含有物との組み合わせが、RGD配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記RGDを有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子の組み合わせである、三次元細胞培養体の製造方法。

【請求項11】
請求項1からのいずれかに記載の検出方法を用いて生体シグナルを検出すること、及び
前記生体シグナルの検出結果に基づき、細胞の活動を解析することを含む、三次元細胞培養体の評価方法。

【請求項12】
三次元細胞培養体と、被検物質である化合物、医薬組成物、化粧品及び食品からなる群から選択される物質とを接触させること、及び、
請求項1からのいずれかに記載の検出方法を用いて三次元細胞培養体の生体シグナルを検出することを含む、被検物質の生体に対する評価方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2010537775thum.jpg
出願権利状態 登録
参考情報 (研究プロジェクト等) さきがけ 界面の構造と制御 領域
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