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酵素活性の測定方法および測定用試薬キット

国内特許コード P120007351
整理番号 PG06E65JP
掲載日 2012年4月23日
出願番号 特願2006-097769
公開番号 特開2007-267680
登録番号 特許第4505651号
出願日 平成18年3月31日(2006.3.31)
公開日 平成19年10月18日(2007.10.18)
登録日 平成22年5月14日(2010.5.14)
発明者
  • 山口 昌樹
出願人
  • 国立大学法人富山大学
発明の名称 酵素活性の測定方法および測定用試薬キット
発明の概要

【課題】唾液などの生物学的試料中に存在する酵素活性の簡便な測定手段を提供する。特に、高濃度の酵素活性含有試料を希釈することなく測定する手段(方法、試薬)を提供する。
【解決手段】修飾基質を用いた酵素法において、基質と競合する基質と分子構造が類似した競合阻害剤及び生成物の生成を阻害する生成物と分子構造が類似した生成阻害剤を添加することにより、高活性値の酵素試料の酵素活性を希釈することなく直接測定する。
【選択図】なし

従来技術、競合技術の概要


アミラーゼ(酵素番号EC3.2.1.1)は膵・唾液腺などで分泌され、主に唾液腺・膵に分布し、その他にも筋肉・卵巣・卵管などに存在していることが知られており、組織から逸脱したアミラーゼが血中や尿中に存在していることも知られている。一部の膵臓・唾液腺、腎・肝機能障害、腫瘍などの疾患においては、血清中や尿中・膵液中のアミラーゼ値が高値を示すことが知られている。これらのアミラーゼ活性の測定方法としては、従来よりCaraway法やオリゴ糖基質を用いた酵素法などが知られている。これらの方法はいずれも数千IU/Lまでのアミラーゼ活性を測定でき、正常値が数十から数百IU/L程度の血清・膵液・尿試料などの測定に用いられてきた。



近年の研究より、唾液アミラーゼ活性値が、被験者のストレスと相関しているとの報告がされており〔非特許文献1〕、唾液試料中のアミラーゼ活性値を測定する方法が望まれている。
しかしながら、唾液中のアミラーゼ活性値は、正常値が数万IU/Lとなるため、従来のアミラーゼ測定法では直接測定することは不可能であった。そのため、試料を希釈するなどの余分な操作が必要となるうえ、数百倍の希釈が必要なため測定精度の低下を招くという問題点が存在する。つまり,必要とされる分析範囲や,リニアリティの良好な検量線を実現するのが困難であった。

【非特許文献1】医用電子と生体工学 39(3), p234-239(2001)、山口昌樹 他

産業上の利用分野


本発明は酵素活性の測定試薬キット及び測定方法に関する。詳しくは、生物学的試料の酵素活性を希釈することなく直接測定する試薬及び方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
基質である修飾オリゴ糖、この基質と拮抗して競合的に作用する競合阻害剤であるオリゴ糖、及びアミラーゼによって産生される反応生成物の生成阻害剤である単糖もしくはオリゴ糖を少なくとも反応系に含み、競合阻害剤の基質に対するモル比が1/10~1、生成阻害剤の基質に対するモル比が1/5~1で支持体に担持されていることを特徴とする唾液中のアミラーゼ活性測定方法。

【請求項2】
合阻害剤と生成阻害剤の添加によって、アミラーゼ活性の測定範囲もしくはリニアリティーが改善される請求項1に記載の方法。

【請求項3】
競合阻害剤の基質に対するモル比が1/10~1/2である請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
生成阻害剤の基質に対するモル比が1/5~1/2である請求項1~れか一に記載の方法。

【請求項5】
基質を1 ~ 100 mM、競合阻害剤を0.25 ~ 25 mM、生成阻害剤を0.4 ~ 40 mMの比率で含有する請求項1~4の何れか一に記載の方法。

【請求項6】
基質である修飾オリゴ糖が、G2~7から選ばれるオリゴ糖であって、還元末端を色原体で修飾されている請求項1~5の何れか一に記載の方法。

【請求項7】
色原体が、4-ニトロフェノール(PNP)、2-クロロ-4-ニトロフェノール(CNP)、2,4-ジクロロフェノール(Cl2P)から選ばれる請求項に記載の方法。

【請求項8】
修飾オリゴ糖が、以下から選ばれる請求項1~7の何れか一に記載の方法;
2-クロロ-4-ニトロフェノール-4-O-β-D-ガラクトピラノシルマルトサイド(以
下 GAL-G2-CNP)、GAL-G4-CNP、GAL-G5-CNP、G5-C
NP、G6-CNP、G7-CNP、G5-PNP、G7-PNP。

【請求項9】
競合阻害剤であるオリゴ糖が、三糖以上である請求項1~8の何れか一に記載の方法。

【請求項10】
競合阻害剤であるオリゴ糖がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオー
スから選ばれる請求項に記載の方法。

【請求項11】
生成阻害剤が、2種類以上添加される請求項1~10の何れか一に記載の方法。

【請求項12】
生成阻害剤が、グルコース、マルトース、マルトトリオースおよびマルトテトラオースから選ばれる少なくとも一である請求項1~11の何れか一に記載の方法。

【請求項13】
修飾オリゴ糖がGAL-G2-CNP、競合阻害剤がマルトペンタオース、生成阻害がマルトースである請求項1~12の何れか一に記載の方法。

【請求項14】
唾液を希釈することなく直接測定する請求項1~13の何れか一に記載の方法。

【請求項15】
請求項1~14の方法に使用する基質、競合阻害剤及び生成阻害剤が少なくとも含まれる
アミラーゼ活性測定用試薬キット。
産業区分
  • 微生物工業
  • 試験、検査
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 権利存続中
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