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フェニルアラニンまたはアラニンの電気化学的測定方法

国内特許コード P120007397
整理番号 S2010-1213-N0
掲載日 2012年4月23日
出願番号 特願2011-066547
公開番号 特開2012-078338
登録番号 特許第5892577号
出願日 平成23年3月24日(2011.3.24)
公開日 平成24年4月19日(2012.4.19)
登録日 平成28年3月4日(2016.3.4)
優先権データ
  • 特願2010-202736 (2010.9.10) JP
発明者
  • 篠原 寛明
  • 須加 実
  • 三浦 将典
出願人
  • 国立大学法人富山大学
  • 味の素株式会社
発明の名称 フェニルアラニンまたはアラニンの電気化学的測定方法
発明の概要 【課題】血液中の濃度が格段に低いPheのセンサによる測定における妨害物質の有効な除去方法を提供し、血液中のPhe濃度を高い精度で測定する方法を提供する。
【解決手段】フェニルアラニン脱水素酵素またはアラニン脱水素酵素とジアホラーゼとを固定化した作用極及び対極を有する電極系を含むPheまたはAlaセンサを用いて血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を測定する方法。以下の(1)~(6)の工程を含む。
(1)被検体である血液を補酵素及び電子メディエーターを含有する試薬液と混合して測定液を調製し、
(2)前記測定液を前記電極系に供給し、
(3)前記電極系の作用極にプラス電位を印加して、前記測定液に含有されるアスコルビン酸及び電子メディエーターを酸化し、
(4)プラス電位の印加を終了し、酵素反応を所定時間実施し、
(5)所定時間経過後、前記電極系の作用極にプラス電位を印加して、電流値を測定し、
(6)測定した電流値またはその積分値に基づいて前記被検体である血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を算出する
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要


アミノ酸は生体内における重要代謝物質であり、血中の遊離アミノ酸濃度を計測することは、医療分野における疾患の診断や病状の判定に非常に有用である。特にフェニルアラニン(Phe)は必須アミノ酸の1つであり、重要な代謝物質であるだけではなく、先天性代謝異常症の代表であるフェニルケトン尿症のバイオマーカーとしても注目される。通常、人の血中Phe濃度は60μM程度であるが、重篤なフェニルケトン尿症患者の場合、血中Phe濃度は1 mM以上にまで上昇する。現在、フェニルケトン尿症は高速液体クロマトグラフィー分析、あるいはPhe選択性の高い酵素を用いる分光法を用いる新生児マススクリーンによって検査されている。浅野らが開発したBacillus badius由来のフェニルアラニン脱水素酵素(PheDH)がこの酵素法で活躍している(非特許文献1、2)。



【化1】




ところで、フェニルケトン尿症患者が在宅での食餌療法などのために血中Pheの簡易測定を行うには、上記高速液体クロマトグラフィー分析や分光法の利用は難しく、それに代わる方法として、電気化学センサ(以下、単にセンサと呼ぶことがある)が適している。フェニルアラニンセンサ(以下、Pheセンサと呼ぶことがある)としては、例えば、特許文献1に記載のものがある。

産業上の利用分野


本発明は、フェニルアラニンまたはアラニンの電気化学的測定方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
フェニルアラニン脱水素酵素またはアラニン脱水素酵素とジアホラーゼとを金電極の表面に固定化した作用極及び対極を有し、作用極面と対極面とが対向する電極系を含むフェニルアラニンまたはアラニンセンサを用いて血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を測定する方法であって、
(1)被検体である血液を補酵素及び電子メディエーターを含有する試薬液と混合して測定液を調製し、
(2)前記測定液を前記電極系に供給し、
(3)前記電極系の作用極に、対極に対するプラス電位を印加して、前記測定液に含有されるアスコルビン酸及び電子メディエーターの全量を酸化し、
(4)プラス電位の印加を終了し、酵素反応を所定時間実施し、
(5)所定時間経過後、前記電極系の作用極にプラス電位を印加して、電流値を測定し、
(6)測定した電流値またはその積分値に基づいて前記被検体である血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を算出する、但し、測定した電流値は、プラス電位印加開始後0.1~60秒の範囲のいずれかの時間に計測される電流値であり、電流値の積分値は、プラス電位印加開始後、60秒間に計測された全てまたは一部の電流値から求めた電気量である、
ことを含む前記測定方法。

【請求項2】
工程(3)におけるプラス電位は、0.3~0.5Vである、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
酵素反応のための所定時間は、10~60秒間である、請求項1~2のいずれかに記載の方法。

【請求項4】
工程(6)におけるフェニルアラニンまたはアラニン濃度の算出は、プラス電位印加開始後0.1~60秒の範囲のいずれかの時間に計測される電流値に基づき、かつ予め作成した検量線を基準にして行う、請求項1に記載の方法。

【請求項5】
工程(6)におけるフェニルアラニンまたはアラニン濃度の算出は、プラス電位印加開始後、60秒間に計測された全てまたは一部の電流値から求めた電気量に基づき、かつ予め作成した検量線を基準にして行う、請求項1に記載の方法。

【請求項6】
被検体である血液の量は0.2~4μLの範囲であり、試薬液の量は0.3~12μLの範囲である請求項1~5のいずれかに記載の方法。
国際特許分類(IPC)
出願権利状態 登録
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