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神経活動を可視化するプローブ 新技術説明会

国内特許コード P120007449
掲載日 2012年5月1日
出願番号 特願2010-524740
登録番号 特許第5624469号
出願日 平成21年8月12日(2009.8.12)
登録日 平成26年10月3日(2014.10.3)
国際出願番号 JP2009064225
国際公開番号 WO2010018840
国際出願日 平成21年8月12日(2009.8.12)
国際公開日 平成22年2月18日(2010.2.18)
優先権データ
  • 特願2008-207546 (2008.8.12) JP
  • 特願2009-024382 (2009.2.5) JP
発明者
  • 石本 哲也
  • 森 寿
  • 和泉 宏謙
出願人
  • 国立大学法人富山大学
発明の名称 神経活動を可視化するプローブ 新技術説明会
発明の概要 生きた動物の中での記憶形成などの脳機能と密接に結びついているCREBやアクチンの動態をリアルタイムで計測するプローブを開発することを目的とする。
N末端側部分とC末端側部分に分割されたルシフェラーゼを含み、
(1)1分子中に、サイクリックAMP応答要素結合蛋白質(CREB)のKIDドメイン、CREB結合蛋白質(CBP)のKIXドメイン、ルシフェラーゼのN末端部分(LucN)及びルシフェラーゼのC末端部分(LucC)を含むプローブ
(2)(a)LucN及びKIDドメインを含む分子、ならびにLucC及びKIXドメインを含む分子の2分子からなるプローブ、若しくは
(b)LucN及びKIXドメインを含む分子、ならびにLucC及びKIDドメインを含む分子の2分子からなるプローブ、又は
(3)アクチン及びLucNを含む分子、ならびにアクチン及びLucNを含む分子の2分子からなるプローブ
のいずれか一以上から選択されるプローブを用いる。
従来技術、競合技術の概要



脳の神経活動にかかわる分子は多種多様であるが、記憶に係わるものとしてcAMP応答要素結合蛋白質(cAMP response element binding protein:以下「CREB」と称する)が知られている。

CREBは転写制御因子であり、セリン133残基のリン酸化により活性化される。

活性化されたCREBは遺伝子のプロモーター領域に存在するCRE配列(TGACGTCA)に結合し、共役因子のCREB結合蛋白質(CREB-binding protein :以下、「CBP」と称する)の存在下に遺伝子発現を引き起こす。

CREBがリン酸化されると、CREBのKID(kinase inducible domein:リン酸化部位+CBP結合部位))のセリン113とCBPのKIX(CREB結合部位)のチロシン(Tyr)658の側鎖が水素結合し、CREBとCBPが安定な転写複合体を形成する。

また、アクチンは、細胞の形状制御やミオシンとの相互作用による細胞の運動性を担っているが、その重合・脱重合が、シナプス伝達の効率を双方向に変えていることが明らかとなり、記憶学習を始めとする神経活動との係わりあいが注目されている。





一方、蛋白質相互作用を解析する方法として、スプリットルシフェラーゼ法が知られている(特許文献1および2)。

【特許文献1】

開2007-325546

【特許文献2】

O02/008766

産業上の利用分野



本発明は、神経活動を可視化するためのプローブおよび該プローブが組み込まれたトランスジェニック動物に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
神経活動を可視化するための1分子又は2分子からなるプローブであって、
(1) 融合蛋白1(NLS-lucN末KID-GGGGSGGGGSGGGGS-KIX-lucC末)もしくは融合蛋白5(NLS-lucN末KID-lucC末)から選択される、1分子からなるプローブ、
(2) 融合蛋白26(NLS-lucN末-KGGRADPAFLYKVE-KID)と融合蛋白33(NLS-KIX-GGGGSGGGGSGGGGS-lucC末)との組み合わせ、
融合蛋白34(NLS-lucN末-GGGGSGGGGSKGGRADPAFLYKVE-KID)と融合蛋白33との組み合わせ、融合蛋白34と融合蛋白44(NLS-lucC末-GGGGSGGGGSGGGGS-KIX)との組み合わせ、
融合蛋白38(NLS-lucN末-KID)と融合蛋白25(NLS-KIX-KGGRADPAFLYKVE-lucC末)との組み合わせ、融合蛋白38と融合蛋白33との組み合わせ、融合蛋白38と融合蛋白44との組み合わせ、
融合蛋白42(NLS-lucN末-GGGGSGGGGSGGGGS-KID)と融合蛋白33との組み合わせ、融合蛋白42と融合蛋白44との組み合わせ、
融合蛋白30(NLS-KID-GGGGSGGGGSGGGGS-lucN末)と融合蛋白33との組み合わせ、
融合蛋白23(NLS-KID-KGGRADPAFLYKVE-lucC末)と融合蛋白28(NLS-lucN末-KGGRADPAFLYKVE-KIX)との組み合わせ、融合蛋白23と融合蛋白32(NLS-KIX-GGGGSGGGGSGGGGS-lucN末)との組み合わせ、融合蛋白23と融合蛋白36(NLS-lucN末-GGGGSGGGGSKGGRADPAFLYKVE-KIX)との組み合わせ、融合蛋白23と融合蛋白41(NLS-lucN末-KIX)との組み合わせ、融合蛋白23と融合蛋白45(NLS-lucN末-GGGGSGGGGSGGGGS-KIX)との組み合わせ、
融合蛋白27(NLS-lucC末-KGGRADPAFLYKVE-KID)と融合
蛋白36との組み合わせ、融合蛋白27と融合蛋白41との組み合わせ、融合蛋白27と
融合蛋白45との組み合わせ、
融合蛋白39(NLS-lucC末-KID)と融合蛋白36との組み合わせ、融合蛋白39と融合蛋白41との組み合わせ、融合蛋白39と融合蛋白45との組み合わせ、
融合蛋白43(NLS-lucC末-GGGGSGGGGSGGGGS-KID)と融合蛋白28との組み合わせ、融合蛋白43と融合蛋白36との組み合わせ、融合蛋白43と融合蛋白41との組み合わせ、融合蛋白43と融合蛋白45との組み合わせ、
融合蛋白31(NLS-KID-GGGGSGGGGSGGGGS-lucC末)と融合蛋白28との組み合わせ、融合蛋白31と融合蛋白36との組み合わせ、融合蛋白31と融合蛋白41との組み合わせ、融合蛋白31と融合蛋白45との組み合わせ、もしくは、融合蛋白31と融合蛋白32との組み合わせ、
から選択される、2分子からなるプローブ、または、
(3) 融合蛋白11(lucN末-KGGRADPAFLYKVE-Actin)と融合蛋白8(Actin-GGGGSGGGGSGGGGS-lucC末)との組み合わせ、融合蛋白11と融合蛋白10(lucC末-KGGRADPAFLYKVE-Actin)との組み合わせ、融合蛋白11と融合蛋白19(Actin-lucC末)との組み合わせ、融合蛋白11と融合蛋白21(Actin-GGGGSGGGGSGGGGS-lucC末)との組み合わせ、
融合蛋白16(Actin-GGGGSGGGGSKGGRADPAFLYKVE-lucN末)と融合蛋白8との組み合わせ、融合蛋白16と融合蛋白10との組み合わせ、融合蛋白16と融合蛋白19との組み合わせ、融合蛋白16と融合蛋白21との組み合わせ、
融合蛋白18(Actin-lucN末)と融合蛋白8との組み合わせ、融合蛋白18と融合蛋白10との組み合わせ、融合蛋白18と融合蛋白19との組み合わせ、融合蛋白18と融合蛋白21との組み合わせ、
融合蛋白20(Actin-GGGGSGGGGSGGGGS-lucN末)と融合蛋白8との組み合わせ、融合蛋白20と融合蛋白10との組み合わせ、融合蛋白20と融合蛋白19との組み合わせ、もしくは、融合蛋白20と融合蛋白21との組み合わせ、
から選択される、2分子からなるプローブ
のいずれか一以上から選択されるプローブ(上記において、lucN末は、配列番号1の1~1245番目の塩基によりコードされる、ルシフェラーゼのN末端側部分を意味し、lucC末は、配列番号1の1246~1653番目の塩基によりコードされる、ルシフェラーゼのC末端側部分を意味する)

【請求項2】
(1) 融合蛋白1もしくは融合蛋白5から選択される、1分子からなるプローブ、
(2) 融合蛋白31と融合蛋白28との組み合わせ、融合蛋白31と融合蛋白36と
の組み合わせ、融合蛋白31と融合蛋白41との組み合わせ、融合蛋白31と融合蛋白4
5との組み合わせ、もしくは、融合蛋白31と融合蛋白32との組み合わせ、
から選択される、2分子からなるプローブ、又は、
(3) 融合蛋白11と融合蛋白10との組み合わせ、融合蛋白11と融合蛋白21と
の組み合わせ、融合蛋白16と融合蛋白19との組み合わせ、融合蛋白16と融合蛋白2
1との組み合わせ、融合蛋白18と融合蛋白21との組み合わせ、もしくは、融合蛋白2
0と融合蛋白21との組み合わせ、
から選択される、2分子からなるプローブ
のいずれか一以上から選択される請求項1に記載のプローブ。

【請求項3】
神経活動を可視化するためのプローブをコードするDNAであって、
(1) 融合蛋白1(NLS-lucN末KID-GGGGSGGGGSGGGGS-KIX-lucC末)をコードする配列を含むDNA、もしくは融合蛋白5(NLS-lucN末KID-lucC末)をコードする配列を含むDNA、
(2) 融合蛋白26(NLS-lucN末-KGGRADPAFLYKVE-KID)をコードする配列と融合蛋白33(NLS-KIX-GGGGSGGGGSGGGGS-lucC末)をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白34(NLS-lucN末-GGGGSGGGGSKGGRADPAFLYKVE-KID)をコードする配列と融合蛋白33をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白34をコードする配列と融合蛋白44(NLS-lucC末-GGGGSGGGGSGGGGS-KIX)をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白38(NLS-lucN末-KID)をコードする配列と融合蛋白25(NLS-KIX-KGGRADPAFLYKVE-lucC末)をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白38をコードする配列と融合蛋白33をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白38をコードする配列と融合蛋白44をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白42(NLS-lucN末-GGGGSGGGGSGGGGS-KID)をコードする配列と融合蛋白33をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白42をコードする配列と融合蛋白44をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白30(NLS-KID-GGGGSGGGGSGGGGS-lucN末)をコードする配列と融合蛋白33をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白23(NLS-KID-KGGRADPAFLYKVE-lucC末)をコードする配列と融合蛋白28(NLS-lucN末-KGGRADPAFLYKVE-KIX)をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白23をコードする配列と融合蛋白32(NLS-KIX-GGGGSGGGGSGGGGS-lucN末)をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白23をコードする配列と融合蛋白36(NLS-lucN末-GGGGSGGGGSKGGRADPAFLYKVE-KIX)をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白23をコードする配列と融合蛋白41(NLS-lucN末-KIX)をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白23をコードする配列と融合蛋白45(NLS-lucN末-GGGGSGGGGSGGGGS-KIX)をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白27(NLS-lucC末-KGGRADPAFLYKVE-KID)をコードする配列と融合蛋白36をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白27をコードする配列と融合蛋白41をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白27をコードする配列と融合蛋白45をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白39(NLS-lucC末-KID)をコードする配列と融合蛋白36をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白39をコードする配列と融合蛋白41をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白39をコードする配列と融合蛋白45をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白43(NLS-lucC末-GGGGSGGGGSGGGGS-KID)をコードする配列と融合蛋白28をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白43をコードする配列と融合蛋白36をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白43をコードする配列と融合蛋白41をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白43をコードする配列と融合蛋白45をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白31(NLS-KID-GGGGSGGGGSGGGGS-lucC末)をコードする配列と融合蛋白28をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白31をコードする配列と融合蛋白36をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白31をコードする配列と融合蛋白41をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白31をコードする配列と融合蛋白45をコードする配列とを含んでなるDNA、もしくは、融合蛋白31をコードする配列と融合蛋白32をコードする配列とを含んでなるDNA、又は、
(3) 融合蛋白11(lucN末-KGGRADPAFLYKVE-Actin)をコードする配列と融合蛋白8(Actin-GGGGSGGGGSGGGGS-lucC末)をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白11をコードする配列と融合蛋白10(lucC末-KGGRADPAFLYKVE-Actin)をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白11をコードする配列と融合蛋白19(Actin-lucC末)をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白11をコードする配列と融合蛋白21(Actin-GGGGSGGGGSGGGGS-lucC末)をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白16(Actin-GGGGSGGGGSKGGRADPAFLYKVE-lucN末)をコードする配列と融合蛋白8をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白16をコードする配列と融合蛋白10をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白16をコードする配列と融合蛋白19をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白16をコードする配列と融合蛋白21をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白18(Actin-lucN末)をコードする配列と融合蛋白8をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白18をコードする配列と融合蛋白10をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白18をコードする配列と融合蛋白19をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白18をコードする配列と融合蛋白21をコードする配列とを含んでなるDNA、
融合蛋白20(Actin-GGGGSGGGGSGGGGS-lucN末)をコードする配列と融合蛋白8をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白20をコードする配列と融合蛋白10をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白20をコードする配列と融合蛋白19をコードする配列とを含んでなるDNA、もしくは、融合蛋白20をコードする配列と融合蛋白21をコードする配列とを含んでなるDNA、
のいずれかから選択されるDNA(上記において、lucN末は、配列番号1の1~1245番目の塩基によりコードされる、ルシフェラーゼのN末端側部分を意味し、lucC末は、配列番号1の1246~1653番目の塩基によりコードされる、ルシフェラーゼのC末端側部分を意味する)

【請求項4】
(1) 融合蛋白1をコードする配列を含むDNA、もしくは融合蛋白5をコードする配列を含むDNA、
(2) 融合蛋白31をコードする配列と融合蛋白28をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白31をコードする配列と融合蛋白36をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白31をコードする配列と融合蛋白41をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白31をコードする配列と融合蛋白45をコードする配列とを含んでなるDNA、もしくは、融合蛋白31をコードする配列と融合蛋白32をコードする配列とを含んでなるDNA、又は、
(3) 融合蛋白11をコードする配列と融合蛋白10をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白11をコードする配列と融合蛋白21をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白16をコードする配列と融合蛋白19をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白16をコードする配列と融合蛋白21をコードする配列とを含んでなるDNA、融合蛋白18をコードする配列と融合蛋白21をコードする配列とを含んでなるDNA、もしくは、融合蛋白20をコードする配列と融合蛋白21をコードする配列とを含んでなるDNA、
のいずれかから選択されるDNAである、請求項3に記載のDNA。

【請求項5】
請求項1に記載のプローブを、神経細胞内に産生させるステップと、
ルシフェラーゼの発光を測定するステップと
を含む、神経活動の可視化方法。

【請求項6】
請求項3に記載のDNAが導入されたげっ歯類。

【請求項7】
請求項3に記載のDNAが導入されたげっ歯類を用いる記憶形成の神経活動を促進する
物質のスクリーニング方法。
国際特許分類(IPC)
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