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RNPモチーフを利用した、蛋白質応答型shRNA/RNAi制御システムの構築

国内特許コード P120007598
整理番号 I029P008JP
掲載日 2012年5月28日
出願番号 特願2010-542114
登録番号 特許第5405489号
出願日 平成21年12月9日(2009.12.9)
登録日 平成25年11月8日(2013.11.8)
国際出願番号 JP2009070580
国際公開番号 WO2010067811
国際出願日 平成21年12月9日(2009.12.9)
国際公開日 平成22年6月17日(2010.6.17)
優先権データ
  • 特願2008-312951 (2008.12.9) JP
発明者
  • 井上 丹
  • 齊藤 博英
  • 樫田 俊一
  • 林 香倫
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 RNPモチーフを利用した、蛋白質応答型shRNA/RNAi制御システムの構築
発明の概要 RNA-蛋白質相互作用モチーフを利用した利用したRNAi制御システムを提供することを目的とする。標的配列に対して相補的な配列を有するガイド鎖と、該ガイド鎖と二本鎖を形成するパッセンジャー鎖と、該ガイド鎖とパッセンジャー鎖とをつなぐリンカー鎖とを備えるshRNAであって、該リンカー鎖が、RNP由来の蛋白質結合モチーフ配列を備えるshRNA、及びかかるshRNAと、該shRNAの蛋白質結合モチーフ配列に特異的に結合するRNP由来の蛋白質とを含んでなるRNAi制御システム。
従来技術、競合技術の概要


RNA干渉(以下、RNAiと記載する)はmRNAを配列特異的に切断することで翻訳を一過的に抑制する現象で、short hairpin RNA(以下、shRNAと記載する)などの二重鎖RNAを導入することでこのRNAiを引き起こす、ノックダウンという手法が様々な生物種で確立されている。RNAiは、発見から10年という短期間で、遺伝子発現を一過的に抑制する簡便、かつ強力な手法として、治療法への検討を含め、広く普及してきている。しかし、そのメカニズムや導入技術については、現在も発展途上である。また、現時点では、ノックダウンを強く効かせるための研究や、目的の部位へRNAを運ぶデリバリー技術の開発が中心である。



Chung等は、shRNAのループ部分に、カフェイン様の低分子化合物として知られているtheophyllineの結合部位を導入した人工RNAを作製し、theophyllineの濃度依存的にRNAiが阻害されることを示した(非特許文献1を参照。)。
【非特許文献1】
Chung-Il An,Vu B.Trinh,and Yohei Yokobayashi,RNA,May 2006;12:710-716

産業上の利用分野



本発明は、RNPモチーフを利用した、蛋白質応答型shRNA/RNAi制御システムの構築に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
細胞内で発現する蛋白質に応答するRNAi制御システムであって、
標的配列のmRNAに対して相補的な配列を有するガイド鎖と、該ガイド鎖と二本鎖を形成するパッセンジャー鎖と、該ガイド鎖とパッセンジャー鎖とをつなぐリンカー鎖であって、BoxCD配列を備えるリンカー鎖とを備えるshRNAを発現するベクターを含み、
前記細胞内で発現するL7Ae蛋白質もしくはL7Ae蛋白質を含む融合蛋白質が、前記shRNAに結合することによりDicerによる前記shRNAの切断を阻害する、システム。

【請求項2】
細胞内で発現する蛋白質に応答するRNAi制御方法(人の細胞に対するin vivoでの方法を除く)であって、
細胞内に、標的配列のmRNAに対して相補的な配列を有するガイド鎖と、該ガイド鎖と二本鎖を形成するパッセンジャー鎖と、該ガイド鎖とパッセンジャー鎖とをつなぐリンカー鎖であって、BoxCD配列を備えるリンカー鎖とを備えるshRNAを発現するベクターを導入する工程を含み、
前記細胞内で発現するL7Ae蛋白質もしくはL7Ae蛋白質を含む融合蛋白質が、前記shRNAに結合することによりDicerによる前記shRNAの切断を阻害する、方法。

【請求項3】
前記shRNAの標的配列が、Bcl-xLのmRNAである、請求項1に記載のRNAi制御システムであって、アポトーシス制御蛋白質を発現制御するRNAi制御システム。

【請求項4】
標的配列のmRNAに対して相補的な配列を有するガイド鎖と、該ガイド鎖と二本鎖を形成するパッセンジャー鎖と、該ガイド鎖とパッセンジャー鎖とをつなぐリンカー鎖であって、BoxCD配列を備えるリンカー鎖とを備えるshRNAであって、
細胞内で発現するL7Ae蛋白質もしくはL7Ae蛋白質を含む融合蛋白質に応答して、Dicerによる前記shRNAの切断を阻害し、前記標的配列のmRNAによりコードされる蛋白質の発現を制御するshRNA。

【請求項5】
前記L7Ae蛋白質もしくはL7Ae蛋白質を含む融合蛋白質を細胞内で発現するベクターをさらに含む、請求項1に記載のRNAi制御システム。

【請求項6】
前記shRNAの標的配列が、GFPのmRNAである、請求項1に記載のRNAi制御システム。

【請求項7】
前記shRNAの標的配列が、Bcl-xLのmRNAである、請求項2に記載のRNAi制御方法であって、アポトーシス制御蛋白質を発現制御するRNAi制御方法。

【請求項8】
前記細胞内に、前記L7Ae蛋白質もしくはL7Ae蛋白質を含む融合蛋白質を該細胞内で発現するベクターを導入する工程をさらに含む、請求項2に記載のRNAi制御方法。

【請求項9】
細胞を破壊することなく、細胞内マーカー蛋白質の発現を定量する方法であって、
GFPのmRNAに対して相補的な配列を有するガイド鎖と、該ガイド鎖と二本鎖を形成するパッセンジャー鎖と、該ガイド鎖とパッセンジャー鎖とをつなぐリンカー鎖であって、BoxCD配列を備えるリンカー鎖とを備えるshRNAが導入された細胞の、GFPの蛍光強度を観測する工程を含む方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録
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