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新規選択マーカー遺伝子およびその利用 実績あり 外国出願あり

国内特許コード P120007662
整理番号 2077
掲載日 2012年6月14日
出願番号 特願2010-514488
登録番号 特許第5499408号
出願日 平成21年5月26日(2009.5.26)
登録日 平成26年3月20日(2014.3.20)
国際出願番号 JP2009059592
国際公開番号 WO2009145180
国際出願日 平成21年5月26日(2009.5.26)
国際公開日 平成21年12月3日(2009.12.3)
優先権データ
  • 特願2008-140083 (2008.5.28) JP
発明者
  • 西村 いくこ
  • 嶋田 知生
  • 島田 貴士
出願人
  • 国立大学法人京都大学
発明の名称 新規選択マーカー遺伝子およびその利用 実績あり 外国出願あり
発明の概要 種子特異的プロモータに作動可能に連結された、種子タンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含んでいるDNA構築物を用いる。これにより、形質転換体植物を作出するために、複雑な工程を必要とせずかつ比較的短時間に目的の形質転換体を得るための技術を提供する。
従来技術、競合技術の概要



形質転換体を作製する場合、薬剤耐性遺伝子が選択マーカーとして一般的に使用されている。しかし、薬剤耐性遺伝子を用いて形質転換体を作製する技術には以下のような欠点がある。

〔1〕植物は育成段階で遺伝子が水平伝播する可能性があるので、薬剤耐性遺伝子を有する植物を野外にて育成するには制限がある。

〔2〕所望の形質転換体を選抜する際に薬剤処理を行う必要があるので、選抜用の薬剤含有培地を別途調製する必要がある。

〔3〕薬剤耐性遺伝子を有している植物であっても、薬剤処理によりダメージを受ける。

〔4〕薬剤含有培地において生存し得ないレベルの形質転換体を得ることが困難である。





これらの問題を解決するために、薬剤耐性遺伝子を有していない形質転換体植物の作出が試みられている(例えば、非特許文献1および2参照)。また、同時形質転換法と呼ばれる手法では、2つのプラスミド(一方が薬剤耐性遺伝子マーカーを含み、他方が目的の形質転換遺伝子を含む。)を同時に植物体に導入し、その後数世代を経ることによって、薬剤耐性遺伝子を有していないが目的の形質転換遺伝子を有している個体を選抜することができる(例えば、非特許文献3参照)。さらに、部位特異的組換え機構を利用して薬剤耐性遺伝子マーカーを形質転換体植物から排除する手法(部位特異的組換え法)も知られている(例えば、非特許文献4~7参照)。

産業上の利用分野



本発明は、新規選択マーカー遺伝子およびその利用に関するものであり、より詳細には、種子タンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子およびその利用に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含んでいるDNA構築物であって、該遺伝子が配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結されていることを特徴とするDNA構築物。

【請求項2】
さらに、目的のタンパク質をコードする第2の遺伝子と、第2の蛍光タンパク質をコードする遺伝子とが上記配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結されており、
該第2の蛍光タンパク質は、上記OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質を構成する蛍光タンパク質とは異なる色の蛍光を発するタンパク質であることを特徴とする請求項1に記載のDNA構築物。

【請求項3】
目的のタンパク質を目的の組織にて発現させるための第2のプロモータをさらに含んでいることを特徴とする請求項1に記載のDNA構築物。

【請求項4】
上記第2のプロモータには、目的のタンパク質をコードする第2の遺伝子と、第2の蛍光タンパク質をコードする遺伝子とが作動可能に連結されており、
該第2の蛍光タンパク質は、上記OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質を構成する蛍光タンパク質とは異なる色の蛍光を発するタンパク質であることを特徴とする請求項3に記載のDNA構築物。

【請求項5】
請求項1~4のいずれか1項に記載のDNA構築物を含んでいることを特徴とする選択マーカー。

【請求項6】
請求項1~4のいずれか1項に記載のDNA構築物を備えていることを特徴とする選択マーカーキット。

【請求項7】
配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結された、OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体植物。

【請求項8】
配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結された、OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子が種子中に存在していることを検出する工程を包含することを特徴とする形質転換体植物を選抜する方法。

【請求項9】
上記検出する工程が、上記蛍光タンパク質による蛍光を種子から検出することを含む、請求項8に記載の方法。

【請求項10】
上記検出する工程が、上記融合タンパク質をコードする遺伝子または上記蛍光タンパク質をコードする遺伝子を種子抽出物から検出することを含む、請求項8に記載の方法。

【請求項11】
さらに、上記配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結された、第2の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が種子中に存在していることを検出する工程を包含し、該第2の蛍光タンパク質は、上記OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質を構成する蛍光タンパク質とは異なる色の蛍光を発するタンパク質である、請求項8に記載の方法。

【請求項12】
さらに、第2のプロモータに作動可能に連結された、第2の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が目的の組織に存在していることを検出する工程を包含し、該第2の蛍光タンパク質は、上記OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質を構成する蛍光タンパク質とは異なる色の蛍光を発するタンパク質である、請求項8に記載の方法。

【請求項13】
植物体内でタンパク質を生産する方法であって、
配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結された、OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含んでいるDNA構築物に、目的のタンパク質をコードする第2の遺伝子を挿入する工程;および
得られたDNA構築物を植物体に導入する工程
を包含することを特徴とする生産方法。

【請求項14】
上記DNA構築物が、目的のタンパク質を目的の組織にて発現させるための第2のプロモータをさらに含んでおり、上記挿入する工程が、第2の遺伝子が第2のプロモータに作動可能に連結することを含む、請求項13に記載の生産方法。

【請求項15】
上記導入する工程が、floral-dip法またはvacuum-infiltration法を行うことを含む、請求項13または14に記載の生産方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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