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鮮度測定用試薬キット

国内特許コード P120007999
整理番号 S2009-0040
掲載日 2012年10月10日
出願番号 特願2010-533879
登録番号 特許第5969731号
出願日 平成21年10月7日(2009.10.7)
登録日 平成28年7月15日(2016.7.15)
国際出願番号 JP2009067502
国際公開番号 WO2010044365
国際出願日 平成21年10月7日(2009.10.7)
国際公開日 平成22年4月22日(2010.4.22)
優先権データ
  • 特願2008-268871 (2008.10.17) JP
発明者
  • 鈴木 徹
  • 濱田 奈保子
  • シリランサアン パウィナー
  • 川井 清司
出願人
  • 国立大学法人東京海洋大学
発明の名称 鮮度測定用試薬キット
発明の概要 複数種類の酵素と酵素保護剤を含有する試薬溶液を凍結乾燥して比較的高い温度における保存安定性の良い鮮度測定用試薬キットを得る。
第一試薬及び第二試薬からなり、該第一試薬は、XODとNPと酵素保護剤と発色剤とを含む第一試薬溶液の凍結物をガラス転移点温度(Tg)以下の温度で減圧乾燥させたものからなり、該第二試薬は、XODとNPとAPと酵素保護剤と発色剤とを含む第二試薬溶液の凍結物をガラス転移点温度(Tg)以下の温度で減圧乾燥させたものからなり、該酵素保護剤はスクロース及び/又はゼラチンからなり、該発色剤はHxがXODによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色するものからなる。
従来技術、競合技術の概要


近年、畜肉、魚肉又は鶏肉等の鮮度はK値が指標として使用されている。K値とはこれらの肉中におけるアデノシン三リン酸(ATP)及びATP分解生成物(ADP,AMP,IMP,HxR,Hx)の含有量に対するイノシン(HxR)及びヒポキサンチン(Hx)の含有量の割合(%)、すなわち(HxR+Hx)×100/(ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx)で表される数値(%)である。ここで、ADPはアデノシン二リン酸、AMPはアデノシン一リン酸、IMPはイノシン酸、HxRとはイノシン、Hxはヒポキサンチンである。



このK値を求めるには畜肉、魚肉又は鶏肉中のATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hxの全ての含有量を測定する必要がある。しかし、これらATP及びATP分解生成物の全ての含有量を測定するのは非常に面倒であるし、魚肉の場合、ATP、ADP、AMPは、魚の死後、時間の経過とともにほとんどがIMP(イノシン酸)に分解しており、ATP、ADP、AMPは非常に少なくなっているので、(HxR+Hx)×100/(IMP+HxR+Hx)で表される数値KiがKi≒KとしてK値の代わりに鮮度の指標として便宜的に用いられている。



ここで、HxRとHxの含有量は、例えば特公昭62-50120号公報に記載されているように、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ(Nucleoside phosphorylase:NP)、キサンチンオキシダーゼ(Xanthine oxidase:XOD)及び発色剤を含む組成液を肉汁に混合し、肉汁中のHxRをヌクレオシドフォスフォリラーゼ(NP)でHxに分解させ、Hxをキサンチンオキシダーゼ(XOD)でキサンチンと尿酸に分解させ、発色剤をHxの分解に共役して発色させ、この発色の強度から求める方法が知られている。



IMPとHxRとHxの含有量は、例えば特開平9-262098号公報に記載されているように、アルカリフォスファターゼ(Alkaline phosphatase:AP)、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ(NP)、キサンチンオキシダーゼ(XOD)を固定したリアクタに肉汁を含んだ試料液を通し、試料液中のイノシン酸(IMP)をアルカリフォスファターゼ(AP)でイノシン(HxR)に分解し、イノシン(HxR)をヌクレオシドフォスフォリラーゼ(NP)でヒポキサンチン(Hx)に分解し、ヒポキサンチン(Hx)をキサンチンオキシダーゼ(XOD)でキサンチンと尿酸に分解させ、ヒポキサンチン(Hx)の濃度を発光試薬で測定することにより求める方法が知られている。



しかし、上述した方法で使用されている各酵素(AP、NP、XOD)は非常に不安定なものであり、時間とともにその活性が容易に低下し、また温度が高いとその活性が更に低下してしまうので、これらの酵素を含む組成物を試薬として商品化することは非常に困難であった。



これらの酵素の不安定さに対しては、例えば特開平8-131196号公報、特表2000-513940号公報、特再WO02/004633号公報、特開2008-206491号公報に記載されているように、酵素の水溶液中に糖(トレハロース、スクロース等)や血清アルブミン(BSA)を添加し、これらを凍結乾燥させることにより、酵素を安定化させる技術がいくつか提案されている。



しかし、糖の種類と酵素の種類との間には酵素の安定化について相性があり、糖と酵素の組合せの仕方によって酵素の安定化の程度が異なり、ある特定の酵素を安定化させる糖の種類や濃度は簡単にはわからない。そして、その酵素が複数種の混合物の場合、それらの酵素を安定化させる糖の種類や濃度は更にわからない。



また、酵素を含む水溶液を凍結後、乾燥させて安定化させる場合、その条件、特に凍結後に温度を上昇させて凍結物を乾燥させる過程における条件も酵素の安定性に大きな影響があるが、その最適条件はわかっていない。そして、酵素が複数種の混合物になった場合、この最適条件は更にわからない。

産業上の利用分野


本発明は、魚肉等の鮮度を容易に短時間で測定することができ、しかも保存安定性の高い鮮度測定用試薬キットに関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
第一試薬及び第二試薬からなり、該第一試薬は、キサンチンオキシダーゼ(Xanthine oxidase:XOD)とヌクレオシドフォスフォリラーゼ(Nucleoside phosphorylase:NP)と酵素保護剤と発色剤とを含む第一試薬溶液の凍結乾燥物からなり、該第二試薬は、キサンチンオキシダーゼ(XOD)とヌクレオシドフォスフォリラーゼ(NP)とアルカリフォスファターゼ(Alkaline phosphatase:AP)と酵素保護剤と発色剤とを含む第二試薬溶液の凍結乾燥物からなり、該第一試薬溶液の凍結乾燥物は鮮度を測定するために必要な酵素活性を備え、該第二試薬溶液の凍結乾燥物は鮮度を測定するために必要な酵素活性を備え、該酵素保護剤はスクロース及び/又はゼラチンからなり、該発色剤はヒポキサンチン(Hx)がキサンチンオキシダーゼ(XOD)によってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色するものからなることを特徴とする鮮度測定用試薬キット。

【請求項2】
前記第一試薬溶液中、キサンチンオキシダーゼ(XOD)が0.1U/ml~10U/mlの濃度範囲に、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ(NP)が0.05U/ml~20U/mlの濃度範囲に、前記第二試薬溶液中、キサンチンオキシダーゼ(XOD)が0.1U/ml~10U/mlの濃度範囲に、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ(NP)が0.05U/ml~20U/mlの濃度範囲に、アルカリフォスファターゼ(AP)が5U/ml~200U/mlの濃度範囲にあることを特徴とする請求項1に記載の鮮度測定用試薬キット。

【請求項3】
前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液中、スクロースが50mM~400mMの濃度範囲にあることを特徴とする請求項1に記載の鮮度測定用試薬キット。

【請求項4】
前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液中、ゼラチンが0.1~2.0(ゼラチンg/試薬溶液100ml)の濃度範囲にあることを特徴とする請求項1に記載の鮮度測定用試薬キット。

【請求項5】
前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液中、発色剤が0.1mM~0.6mMの濃度範囲にあることを特徴とする請求項1に記載の鮮度測定用試薬キット。

【請求項6】
前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液のpHが6.8~8.5であることを特徴とする請求項1又は2に記載の鮮度測定用試薬キット。

【請求項7】
前記発色剤がWST-8であることを特徴とする請求項1に記載の鮮度測定用試薬キット。

【請求項8】
前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液が血清アルブミン(BSA)を含有していることを特徴とする請求項1に記載の鮮度測定用試薬キット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2010533879thum.jpg
出願権利状態 登録


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