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ペプチドのスクリーニング方法 コモンズ

国内特許コード P120008404
整理番号 DP1418
掲載日 2012年12月10日
出願番号 特願2010-019731
公開番号 特開2011-158341
登録番号 特許第5718574号
出願日 平成22年1月29日(2010.1.29)
公開日 平成23年8月18日(2011.8.18)
登録日 平成27年3月27日(2015.3.27)
発明者
  • 西川 喜代孝
  • 高橋 美帆
  • 加藤 美帆子
出願人
  • 学校法人同志社
発明の名称 ペプチドのスクリーニング方法 コモンズ
発明の概要 【課題】従来のスクリーニング方法に加え、クラスター効果を有する標的タンパク質に結合するペプチドを、より厳密かつ効率的に特定することができるスクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】ランダム多価ライブラリー法によって、1以上のアミノ酸非特定部位が存在する標的タンパク質結合モチーフを決定し、シート上に合成されたペプチド毎にアミノ酸非特定部位のアミノ酸(Cysを除く)が異なる多価ペプチドライブラリーへ標的タンパク質のブロットする。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要


Shiga toxin (Stx)は、腸管出血性大腸菌が産生する主要な病原因子であり、消化管障害のみならず、その後の一連の微小血管障害である重症合併症〔たとえば、溶血性尿毒症症候群(HUS)〕などを引き起こすことが知られている。



そして、この出願の発明者は、これまでに、Stx1およびStx2のBサブユニットとグロボ3糖の結合にはクラスター効果が存在するとの知見から、多価型ペプチドライブラリーを利用したスクリーニング方法を確立している(特許文献1)。



ここで、「クラスター効果」とは、ある機能分子とそのリガンドとの相互作用において、1対1の場合に比べて多価対多価の相互作用によって、著しくその結合親和性が亢進する現象をいう。特許文献1では、ペプチドライブラリーを多価にすることによって、Stx2のBサブユニットとの間にクラスター効果を発揮させ、Stx2との高結合親和性を有するStx2阻害ペプチドを特定している。



しかしながら、特許文献1のスクリーニング方法では、例えば、野生型STXと、このミュータントに対してランダム多価ライブラリーを接触させて、各々のpositionで得られたアミノ酸について、どのアミノ酸がどの程度の強さで選択されるかを示す数値化された結果を得ている。



このため、標的タンパク質の種類、あるいは、標的部位によっては、各々のpositionで選択されるアミノ酸の選択性が低い場合がある。また、標的部位に荷電アミノ酸がない、あるいは少ない場合には、Met、Val、IIe、Phe、Trpなどの疎水的アミノ酸が選択されやすいため、各positionの選択性に影響を与える。このため、結果として選択された結合モチーフが、必ずしも十分な結合性を有していない場合があった。



また、特許文献1のスクリーニング方法は、各positionのアミノ酸の選択性に基づいて結合モチーフを決定しているため、選択性の強いアミノ酸を組合せた結合モチーフが、結果として必ずしも十分な結合性を有していない場合があった。



このように、この出願の発明者は、特許文献1のスクリーニング方法では、結合モチーフの同定に一定の成果が得られるもの、確実に結合性の高い結合モチーフを抽出することが難しいという点において、改善すべき課題があるとの認識に至った。また、例えば、選択性の判断が難しいpositionにおいて、特定のアミノ酸を組み込んで結合性を評価することは、コストの面から現実的ではなかった。



また、特許文献1のスクリーニング方法は、一度に得られる結合モチーフの数が数個に限られており、スクリーニングの効率性においても改善すべき点があると考えられた。

産業上の利用分野


本発明は、標的タンパク質との結合性を有するペプチドのスクリーニング方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
クラスター効果を有する標的タンパク質との結合性を有するペプチドのスクリーニング方法であって、以下のステップ:
(A)以下(1)~(3)のステップ、
(1)野生型の標的タンパク質の受容体結合サイトのうちの一つにミューテーションを導入し、ミュータントを作成するステップ、
(2)野性型と前記ミュータントに、degenerate positionを含むペプチドモチーフを複数有する多価ペプチドライブラリーを反応させるステップ、および
(3)野性型と結合した多価ペプチドライブラリーのペプチドモチーフと、前記ミュータントと結合した多価ペプチドライブラリーのペプチドモチーフとを対比し、アミノ酸選択比の高いアミノ酸をペプチドモチーフのdegenerate position のアミノ酸として特定するステップ、
を含むランダム多価ライブラリー法を用いて、1以上のアミノ酸非特定部位が存在する標的タンパク質結合モチーフを決定するステップ;
(B)シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、2価ペプチドの合成核構造または4価ペプチドの合成核構造を形成し、このペプチド合成核構造から、標的タンパク質結合モチーフのアミノ酸配列からなる2価または4価ペプチドを伸長させて、ペプチド毎にアミノ酸非特定部位のアミノ酸(Cysを除く)が異なる多価ペプチドライブラリーを作成するステップ;
(C)多価ペプチドライブラリーの各々の2価ペプチドまたは4価ペプチドに標的タンパク質をブロットするステップ;
(D)標的タンパク質が結合したペプチドが、目的ペプチドであると決定するステップ;
を含むことを特徴とするペプチドのスクリーニング方法。

【請求項2】
ペプチド合成核構造は、リジンを含むことを特徴とする請求項1のスクリーニング方法。

【請求項3】
標的タンパク質は、STX1またはSTX2、STX1c、STX2c、 STX2e、STX2d、STX2f、コレラ毒素、易熱性エンテロトキシン、HAタンパク質、gp120、セレクチン、アディポネクチンのうちの1種または2種以上であることを特徴とする請求項1のスクリーニング方法。

【請求項4】
請求項1のスクリーニング方法に使用されるキットであって、シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、2価ペプチドの合成核構造または4価ペプチドの合成核構造が形成されている特徴とするスクリーニング用キット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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