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ニゲロースホスホリラーゼ

国内特許コード P130008522
掲載日 2013年2月7日
出願番号 特願2011-130340
公開番号 特開2012-254061
出願日 平成23年6月10日(2011.6.10)
公開日 平成24年12月27日(2012.12.27)
発明者
  • 仁平 高則
  • 中井 博之
  • 北岡 本光
出願人
  • 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
発明の名称 ニゲロースホスホリラーゼ
発明の概要 【課題】ニゲロース加リン酸分解活性を有する酵素の提供。
【解決手段】ニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解してグルコースとβ-グルコース1リン酸を生成する活性を有する酵素。
【選択図】図3
従来技術、競合技術の概要


ホスホリラーゼは、グリコシド結合を加リン酸分解する酵素の総称である。ホスホリラーゼは、その可逆的な加水分解反応や厳密な反応位置特異性から、特定のオリゴ糖の調製に有用であることが知られている。ホスホリラーゼの反応の可逆性を利用して、様々なオリゴ糖が対応する糖1-リン酸から逆反応を用いて合成されている(非特許文献1~3及び特許文献1)。単独のホスホリラーゼを用いて、又は2つのホスホリラーゼを組み合わせて用いて、より安価な原料からオリゴ糖を生成することも可能になっている。



従来クローニングされている反転型ホスホリラーゼは全て、CAZyデータベース(http://www.cazy.org)中でグリコシドヒドロラーゼ(GH)ファミリー65、94又は112に分類されている。グリコシドヒドロラーゼ(GH)ファミリー65は、α-D-グルコシル結合を加リン酸分解してβ-D-グルコース1-リン酸(β-グルコース1-リン酸;β-G1P)を生成するホスホリラーゼを含有するファミリーである。現在では、トレハロースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.64)、コージビオースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.230)、マルトースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.8)及びトレハロース6-リン酸ホスホリラーゼ(EC 2.4.1.216)が、GH65酵素のメンバーとして知られている。



しかしながら、既知のホスホリラーゼの基質特異性のバリエーションはまだ少ない。そのため、ホスホリラーゼを用いたオリゴ糖製造法を適用可能な範囲はなおも限定されている。このため新規な基質特異性を有するホスホリラーゼの取得がなおも望まれている。例えば、グルコース2分子がα-1,3結合したグルコシル二糖であるニゲロースを特異的に加リン酸分解するホスホリラーゼは、ホスホリラーゼを用いたニゲロースの製造に重要であると考えられるが、そのような酵素はこれまで報告されていない。

産業上の利用分野


本発明は、ホスホリラーゼ酵素及びその利用に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
ニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解してグルコースとβ-グルコース1リン酸を生成する活性を有する酵素。

【請求項2】
基質濃度10mMのコージビオース、マルトース及びトレハロースに対する加リン酸分解活性が、基質濃度10mMのニゲロースに対する加リン酸分解活性と比較していずれも5%以下である、請求項1に記載の酵素。

【請求項3】
(a)30℃の条件下で至適pHが6.5~7.5であり、pH5.5~9.0で安定であり、
(b)pH7.0の条件下で至適温度が40℃であり、15℃~40℃の範囲で安定であり、
(c)ゲルろ過法で測定した分子量が200kDaであり、
(d)二量体であり、
(e)クロストリディウム・フィトファーメンタンス由来である、
請求項1又は2に記載の酵素。

【請求項4】
以下の(a)又は(b)のタンパク質から構成される、請求項1~3のいずれか1項に記載の酵素。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1~数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニゲロースを特異的かつ可逆的に加リン酸分解してグルコースとβ-グルコース1リン酸を生成する活性を有するタンパク質

【請求項5】
請求項1~4のいずれか1項に記載の酵素を、リン酸存在下でニゲロースと反応させることを含む、ニゲロースの分解方法。

【請求項6】
請求項1~4のいずれか1項に記載の酵素を、β-グルコース1リン酸、及び単糖若しくはその誘導体と反応させてα-グルコシル結合を生成することを含む、α-グルコシル結合を有する二糖の製造方法。

【請求項7】
単糖若しくはその誘導体がグルコース、ガラクトース、キシロース、1,5-アンヒドロ-グルシトール、グルクロン酸、及びα-メチルグルコシドからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。

【請求項8】
単糖若しくはその誘導体がグルコースであり、製造されるα-グルコシル結合を有する二糖がニゲロースである、請求項6又は7に記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2011130340thum.jpg
出願権利状態 公開


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