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変異型逆転写DNAポリメラーゼ コモンズ 新技術説明会

国内特許コード P130009466
整理番号 KG0071-JP02
掲載日 2013年7月3日
出願番号 特願2010-535773
登録番号 特許第5641939号
出願日 平成21年10月23日(2009.10.23)
登録日 平成26年11月7日(2014.11.7)
国際出願番号 JP2009068289
国際公開番号 WO2010050418
国際出願日 平成21年10月23日(2009.10.23)
国際公開日 平成22年5月6日(2010.5.6)
優先権データ
  • 特願2008-276613 (2008.10.28) JP
発明者
  • 藤原 伸介
  • 佐野 創太郎
出願人
  • 学校法人関西学院
発明の名称 変異型逆転写DNAポリメラーゼ コモンズ 新技術説明会
発明の概要 本発明は、逆転写活性及び耐熱性に優れるDNAポリメラーゼを提供することを課題とする。また、本発明は、効率性に優れるcDNA合成方法又は増幅方法を提供することも課題とする。
本発明は、上記課題の解決手段として、配列番号1のアミノ酸配列において、326番目、329番目、384番目、388番目、408番目、及び438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸がアラニンに置換されており、逆転写活性と耐熱性に優れている変異型DNAポリメラーゼを提供する。さらに本発明は、上記課題の解決手段として、当該変異型DNAポリメラーゼを利用するcDNA合成方法及びcDNA増幅方法を提供する。
従来技術、競合技術の概要


RNAを鋳型としてそれに相補的なDNA(complementary DNA;cDNA)を合成する反応が知られており、この反応は逆転写反応と呼ばれる。DNAポリメラーゼのうちこの逆転写反応を触媒する活性(逆転写活性)を有するものは逆転写酵素と呼ばれる。



mRNAに対応するcDNAの合成は分子生物学分野の研究活動において非常に重要であり、逆転写酵素がこのために広く利用されている。



また、RNAを鋳型としてcDNAを迅速かつ正確に数千倍から数万倍に増幅する、逆転写PCR(Reverse Transcription-PCR: RT-PCR)は、組織や細胞における遺伝子発現研究のための強力なツールとして活用されており、逆転写酵素がこのためにも広く利用されている。



従来、逆転写酵素としてはレトロウイルス(retrovirus)由来の逆転写活性を有するDNAポリメラーゼが用いられてきた。しかしながら、これらの逆転写酵素はタンパク質変性を起こしやすく不安定であった。そのため、これらの逆転写酵素を使用する場合はそのタンパク質変性を回避するために比較的低温での逆転写反応を余儀なくされるが、そのような低温条件下ではRNAの高次構造が維持されたままとなるため逆転写反応が進みにくいという問題点があった。



そこで、逆転写活性と耐熱性とを兼ね備える逆転写酵素が求められている。そのような逆転写酵素として、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)由来のDNAポリメラーゼ、及びそのアミノ酸置換体が報告されている(特許文献1)。また、Thermus sp Z05由来DNAポリメラーゼとThermotoga maritima由来のDNAポリメラーゼとからなるキメラタンパク質のアミノ酸置換体が報告されている(非特許文献1)。しかしながら、これらのDNAポリメラーゼは逆転写活性及び耐熱性の面でさらに改良すべき点があった。

産業上の利用分野


本発明は、変異型逆転写DNAポリメラーゼに関する。また本発明は、変異型逆転写DNAポリメラーゼを用いRNAを鋳型としてcDNAを合成又は増幅する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の(A)又は(B)のポリペプチド:
(A)配列番号1のアミノ酸配列において、326番目、329番目、384番目、388番目、408番目、及び438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド;
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。

【請求項2】
以下の(A)又は(B)のポリペプチド:
(A)配列番号1のアミノ酸配列において、326番目及び408番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド;
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。

【請求項3】
以下の(A)又は(B)のポリペプチド:
(A)配列番号1のアミノ酸配列において、329番目及び/又は384番目のアミノ酸がアラニンに置換されており、かつ326番目及び408番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド;
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。

【請求項4】
以下の(A)又は(B)のポリペプチド:
(A)配列番号1のアミノ酸配列において、326番目のアミノ酸がアラニンに置換されており、かつ388番目、408番目、及び438番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド;
(B)(A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態で1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されることにより、(A)のポリペプチドのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有するポリペプチド。

【請求項5】
配列番号1のアミノ酸配列において、326番目又は408番目のいずれか一つのアミノ酸がアラニンに置換されているポリペプチド。

【請求項6】
請求項1~5いずれかに記載のポリペプチドを含むcDNA合成キット。

【請求項7】
請求項1~5いずれかに記載のポリペプチドを含むRT-PCRキット。

【請求項8】
RNAを鋳型として逆転写DNAポリメラーゼによりcDNAを合成する方法であって、前記逆転写DNAポリメラーゼとして請求項1~5いずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする方法。

【請求項9】
RNAを鋳型として逆転写DNAポリメラーゼを利用したRT-PCRによりcDNAを増幅する方法であって、前記逆転写DNAポリメラーゼとして請求項1~5いずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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