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一塩基多型の検出方法

国内特許コード P130009533
整理番号 515
掲載日 2013年7月10日
出願番号 特願2007-501513
登録番号 特許第4752071号
出願日 平成17年12月14日(2005.12.14)
登録日 平成23年6月3日(2011.6.3)
国際出願番号 JP2005022985
国際公開番号 WO2006082685
国際出願日 平成17年12月14日(2005.12.14)
国際公開日 平成18年8月10日(2006.8.10)
優先権データ
  • 特願2005-025644 (2005.2.1) JP
発明者
  • 中谷 和彦
  • 須田 仁志
  • 小堀 哲生
出願人
  • 国立大学法人京都大学
発明の名称 一塩基多型の検出方法
発明の概要

本発明は、(A)I)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、又はII)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、と、(B)バルジ塩基認識可能な化合物と、(C)前記評価対象核酸と、を混合し、前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に形成されるシトシンバルジ又はチミンバルジを認識する前記(B)の化合物に基づくシグナルを検出し、前記一塩基多型を評価することを特徴とする一塩基多型の検出方法、並びにそのキットを提供する。

従来技術、競合技術の概要

一塩基多型(SNPs)は、ゲノムDNA上に存在する個体間の違いであり、ヒト等における種々の疾患や種々の表現形質の違いを生じうる。したがって、かかるSNPsは、遺伝子疾患の解析、個体間の識別等に利用されている。


前記SNPsの検出は、例えば、電気泳動における移動度の違い、プライマー伸長、蛍光物質、放射性物質等の標識物質により標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーション、PCRによる増幅等に基づくタイピング等による検出方法等により行なわれている。


前記検出方法としては、具体的には、例えば、分析対象DNA断片と基準DNA断片とについて、多型による二次構造の差異の拡大を指標として電気泳動における断片の分離が大きくなる温度条件下に、ヘテロ接合型の基準DNA断片と、分析対象DNA断片とを、同一のキャピラリで同時に、電気泳動分離し、前記基準DNA断片によりピークの補正を行ない、分析対象DNA断片のヘテロ接合性の消失の有無を調べる、検出方法(特許文献1);試料中に含まれる特定の一塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び1種又は2種の変異型用プライマーを同時に又は別々に、DNAポリメラーゼと共に作用させ、プライマーに基づく伸長の有無を調べる、検出方法(特許文献2);解析対象のゲノムDNAと複数対のプライマーとを用いて、少なくとも1つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を増幅し、タイピングを行なう、検出方法(特許文献3);一塩基多型部位を含む基準配列用及び変異配列用の2種の特異的プライマーとユニバーサルプライマーとを用いて、目的配列部分を増幅し、得られた反応液を電気泳動し、増幅産物の有無を調べる、検出方法(特許文献4);生物学的試料と、標的核酸の領域が変更のない場合に該領域に連続的にハイブリダイズする複数の一本鎖ペプチド核酸とを接触させ、ついで、ミスマッチ核酸(一本鎖核酸)を分解する薬剤を添加し、その後、分解産物の存在を調べる、検出方法(特許文献5)等が挙げられる。


しかしながら、前記特許文献に記載の手法によれば、電気泳動における温度条件の検討、電気泳動、ピークの補正、DNAポリメラーゼ反応の条件の検討、伸長の有無の検出のための条件の設定、増幅反応条件の検討、タイピングのための条件の検討、増幅反応条件の検討、増幅産物の有無の検出等の複数の複雑な手順を組み合わせて行なわれるため、操作が煩雑であり、時間を要するという欠点がある。

【特許文献1】特開2002-78500号公報
【特許文献2】国際公開第01/042498号パンフレット
【特許文献3】特開2002-300894
【特許文献4】特開2003-52372
【特許文献5】特表2004-521630

産業上の利用分野

本発明は、標的となる核酸中の一塩基多型を検出する方法及びそのキットに関する。さらに詳しくは、標的となる核酸中の一塩基多型を、簡便に、高感度に検出する方法及びそのキットに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】 (A))少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、又は
ii)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
(B)バルジ塩基認識可能な化合物と、
(C)前記評価対象核酸と、
を混合し、
前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に形成されるシトシンバルジ又はチミンバルジを認識する前記(B)の化合物に基づくシグナルを検出し、
前記一塩基多型を評価することを特徴とする一塩基多型の検出方法であって、
前記(B)バルジ塩基認識可能な化合物が、2,7-ジアミノナフチリジン誘導体化合物である、一塩基多型の検出方法。
【請求項2】 下記1)~4):
1)前記一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
2)前記一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
3)前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、及び
4)前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
のそれぞれに結合した前記(B)のバルジ塩基を認識可能な化合物に基づくシグナルの変動に基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する、請求項1記載の検出方法。
【請求項3】 前記シグナルが蛍光である請求項1又は2に記載の検出方法。
【請求項4】 前記2,7-ジアミノナフチリジン誘導体化合物が、下記式(II):
【化学式1】
に示される2,7-ジアミノ-1,8-ナフチリジンである、請求項1~3いずれか1項に記載の検出方法。
【請求項5】 i’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
ii’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
i’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
ii’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
バルジ塩基を認識可能な2,7-ジアミノナフチリジン誘導体化合物
を含有してなる、請求項1~4いずれか1項に記載の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキット。
産業区分
  • 微生物工業
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 権利存続中
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