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哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上剤

国内特許コード P130009711
掲載日 2013年7月26日
出願番号 特願2012-505492
登録番号 特許第5578338号
出願日 平成23年3月13日(2011.3.13)
登録日 平成26年7月18日(2014.7.18)
国際出願番号 JP2011001449
国際公開番号 WO2011114678
国際出願日 平成23年3月13日(2011.3.13)
国際公開日 平成23年9月22日(2011.9.22)
優先権データ
  • 特願2010-057732 (2010.3.15) JP
発明者
  • 赤田 倫治
  • 中村 美紀子
出願人
  • 国立大学法人山口大学
発明の名称 哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上剤
発明の概要 本発明の課題は、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上剤や、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上方法や、哺乳動物細胞の形質転換方法を提供することにある。tRNAをリポフェクション試薬と併用することを特徴とする。好適には、リポフェクション溶液中のtRNA濃度が3~50μg/mLの範囲内であって、培養液中の濃度が約1/10になるように用いることができる。より好適には、tRNA及びPEGをリポフェクション試薬と併用することができる。本発明によれば、哺乳動物細胞への高い遺伝子導入効率を得ることができる。
従来技術、競合技術の概要



細胞への遺伝子導入方法には様々なものが知られている。例えば、生物学的方法としては、ウイルスベクターを利用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法が知られており、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法、超音波遺伝子導入法が知られており、化学的方法としては、リン酸カルシウム共沈殿法、リポソーム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、アルカリ金属法が知られている。上記リポフェクション法は、陽性荷電脂質等からなる脂質二重膜小胞(リポソーム)と、導入するDNAとの間の電気的な相互作用によって、リポソーム-DNA複合体を形成させ、その複合体を貪食や膜融合によって宿主細胞に取り込ませる方法である。DNAを必ずしもリポソーム内に封入しない点で、リポフェクション法は、リポソーム法と区別される。一般的に、遺伝子導入を行う場合には簡便さの点から、まずはリポフェクション法がおこなわれる。リポフェクション法は、汎用性及び簡便性が高く、また、多サンプル処理に適しているというメリットを有しているため、比較的広く用いられている。しかし、このリポフェクション法は、遺伝子導入効率の点で、エレクトロポレーション法や、ウイルスベクターを利用する方法に劣っているというデメリットもあった。一方、ウイルスベクターを利用する方法には、高い遺伝子導入効率を有するといったメリットがある反面、1)ウイルスベクターに目的遺伝子を入れた後、かかるウイルスベクターをウイルス産生細胞に導入し、その後目的遺伝子を含むウイルスを産生し、かかるウイルスを細胞に感染させるまで1週間程度もの時間が必要、2)ウイルスベクターを扱う施設が必要、3)ウイルスベクターを扱うのに十分な熟練の技術者が必要、4)ウイルスベクターが体細胞ゲノムに挿入され、残ってしまう場合があること、などの問題があった。したがって、ウイルスベクターを利用せずに、効率よく遺伝子導入する方法を開発できれば、有用な方法となる。





本発明者らは、これまでに、酵母への遺伝子導入効率を向上させる研究を行ってきた。例えば特許文献1には、酵母培養液に直接、該酵母細胞に導入するDNA、アルカリ金属イオンおよびポリエチレングリコール(PEG)を含有する溶液を混合して、形質転換を行なうことを特徴とする酵母の形質転換法が記載されている。また、特許文献1には、上記の混合溶液に、キャリアDNAやキャリアRNAをさらに用いることが記載されている。しかし、この特許文献1の方法は、酵母細胞を対象とし、また、アルカリ金属法に基づいた方法である。一方、本願発明の方法は、哺乳動物細胞を対象とし、また、リポフェクション法に基づいた方法であるため、特許文献1の方法とは全く異なる。加えて、特許文献1は、tRNAについて何ら教示していない。なお、酵母細胞は細胞壁を有するため、リポフェクション法は通常用いられない。





ところで、特許文献2には、哺乳動物細胞を宿主細胞とし、遺伝子導入効率が高い形質転換法が記載されている。特許文献2の形質転換法は、哺乳動物複製開始領域と、哺乳動物核マトリックス結合領域とを含む第1ベクター、および哺乳動物細胞内において機能するプロモーターと、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを含む第2ベクターを、第2ベクターに対する第1ベクターのモル比が0.3~5の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入することを特徴としている。また、非特許文献1や非特許文献2には、特定の分子量のポリエチレングリコールを用いると、遺伝子導入効率が向上することが開示されている。しかし、上記のいずれの文献にも、哺乳動物細胞の遺伝子導入の際に、tRNAを用いることについて、何ら教示はない。

産業上の利用分野



本発明は、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上剤や、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上方法や、哺乳動物細胞の形質転換方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
目的遺伝子を含むDNAと混合して用いるためのトランスファーRNA(tRNA)と、目的遺伝子を含むDNAとtRNAとの混合液に添加するためのリポフェクション試薬とを含有することを特徴とする、インビトロにおいて哺乳動物細胞へ遺伝子導入効率を向上させる向上剤。

【請求項2】
さらにポリエチレングリコールを併用することを特徴とする請求項1記載の向上剤。

【請求項3】
ポリエチレングリコールの分子量が、2000~6000の範囲内であることを特徴とする請求項に記載の向上剤。

【請求項4】
ポリエチレングリコールの分子量が、3000~5000の範囲内であることを特徴とする請求項に記載の向上剤。

【請求項5】
リポフェクション溶液中のtRNA濃度が3~50μg/mLの範囲内となるように用いることを特徴とする請求項1~4のいずれかに記載の向上剤

【請求項6】
以下の工程(a)~(c)を順次備えることを特徴とする、インビトロにおいて哺乳動物細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法。
(a)目的遺伝子を含むDNAと、tRNAとを混合する工程;
(b)前記工程(a)により作製された混合液に、リポフェクション試薬を添加する工程;
(c)前記工程(b)により作製されたリポフェクション溶液を、インビトロにおいて哺乳動物細胞に添加する工程;

【請求項7】
工程(b)において、ポリエチレングリコールを併用することを特徴とする請求項記載の方法。

【請求項8】
以下の工程(a)~(c)を順次備えることを特徴とする、インビトロにおける哺乳動物細胞の形質転換方法。
(a)目的遺伝子を含むDNAと、tRNAとを混合する工程;
(b)前記工程(a)により作製された混合液に、リポフェクション試薬を添加する工程;
(c)前記工程(b)により作製されたリポフェクション溶液を、インビトロにおいて哺乳動物細胞に添加し、目的遺伝子を哺乳動物細胞へリポフェクションする工程;

【請求項9】
工程(b)において、ポリエチレングリコールを併用することを特徴とする請求項8記載の方法。
産業区分
  • 高分子化合物
  • 薬品
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
山口TLOは平成11年11月に山口大学の教官50名の出資により設立された、リエゾン一体型のTLO活動会社です。山口大学を主とし、山口県内の大学・高専の研究成果をご紹介致します。特許の内容に興味を持たれた方は、下記までご連絡ください。


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