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オリゴヌクレオチドの製造方法 コモンズ

国内特許コード P130010053
掲載日 2013年11月14日
出願番号 特願2012-068494
公開番号 特開2013-198425
出願日 平成24年3月24日(2012.3.24)
公開日 平成25年10月3日(2013.10.3)
発明者
  • 小野 晶
  • 岡本 到
出願人
  • 学校法人神奈川大学
発明の名称 オリゴヌクレオチドの製造方法 コモンズ
発明の概要

【課題】オリゴヌクレオチドの自動合成機にも適用可能であり、ホスホジエステル構造とホスホトリエステル構造とを備えたオリゴヌクレオチドの製造方法を提供すること。
【解決手段】ホスホアミダイド法によるオリゴヌクレオチドの合成手順において、亜リン酸部位に結合された保護基の異なる少なくとも二系統のホスホアミダイド化合物を使用し、その一の系統のホスホアミダイド化合物として亜リン酸保護基がジオキソレノン骨格を有する置換基であるものを使用する。これにより、ホスホアミダイド法によるオリゴヌクレオチドの合成手順におけるヨウ素酸化工程で、上記一の系統のホスホアミダイド化合物由来のリン酸のみが脱保護されてホスホジエステル構造となり、他の系統のホスホアミダイド化合物由来のリン酸は脱保護を受けずにホスホトリエステル構造となる。
【選択図】図1

従来技術、競合技術の概要


今日、DNA(デオキシリボ核酸)やRNA(リボ核酸)といった核酸の合成法は確立されており、短鎖の核酸であるオリゴヌクレオチドの自動合成機を用いた合成も行われている。こうして得られた合成オリゴヌクレオチドは、生命科学研究や医療診断等のために日常的に使用されている。このような合成オリゴヌクレオチドの有用な用途の一つに、核酸医薬がある。



核酸医薬とは、合成オリゴヌクレオチドより構成される薬物であり、細胞の代謝経路を阻害することで治療効果を得るものである。このような核酸医薬を説明するための一例として、アンチセンス法(非特許文献1を参照。)を説明する。アンチセンス法では、疾患の原因となるタンパク質の合成を阻害するために、このタンパク質をコードする遺伝子から転写されたmRNAを標的とする。この場合、標的となるmRNAに相補的なオリゴヌクレオチドを細胞外から導入し、当該オリゴヌクレオチドとmRNAとの間で二重鎖を形成させることでmRNAからタンパク質への翻訳過程を阻害する。



上記のような作用を発現させるためには、核酸医薬となるオリゴヌクレオチドが細胞膜を通過して細胞内に到達することが必要である。このような手段の一つとして、細胞膜透過性を有するキャリア粒子の内部にオリゴヌクレオチドを取り込ませ、当該キャリアごとオリゴヌクレオチドを細胞内に送り込む方法が提案されている(例えば、特許文献1を参照)。

産業上の利用分野


本発明は、オリゴヌクレオチドの製造方法に関し、さらに詳しくは、オリゴヌクレオチド鎖の中にホスホジエステル構造とホスホトリエステル構造とを備えたオリゴヌクレオチドの製造方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
ホスホアミダイド化合物の亜リン酸基に含まれる2つのOH基の一方にヌクレオシドが結合されるとともに他方に第一保護基が結合され、さらに前記ヌクレオシドの5’-水酸基に第二保護基が結合されたホスホアミダイド化合物を使用するオリゴヌクレオチドの製造方法であって、
固相担体にオリゴヌクレオチドを伸長させるためのリンカーを結合させた後に、当該リンカーの末端に、オリゴヌクレオチドの配列における一番目の塩基に対応し、5’-水酸基に第二保護基を有するヌクレオシドを結合させる初期伸長工程と、
伸長しているヌクレオチド鎖の5’-末端の水酸基に結合した第二保護基を脱離させて、新たな伸長末端となる5’-末端の水酸基を出現させる第二保護基脱離工程と、
前記第二保護基脱離工程により出現した伸長末端に、所望の塩基に対応する前記ホスホアミダイド化合物を作用させて前記所望の塩基に対応するヌクレオチド鎖を伸長させる伸長工程と、
前記伸長工程により伸長されたヌクレオチドの末端に位置する亜リン酸基をヨウ素で酸化してリン酸基に変換する酸化工程と、を備え、
前記第二保護基脱離工程から前記酸化工程までを繰り返し実行することによりヌクレオチド鎖が伸長され、
前記ホスホアミダイド化合物には第一保護基の異なる少なくとも二系統の化合物が含まれ、その一の系統のホスホアミダイド化合物における前記第一保護基が下記一般式(1)で表されるものであることにより、当該下記一般式(1)で表される第一保護基のみが前記酸化工程にてヨウ素の作用を受けて脱離されることを特徴とする、ホスホジエステル構造とホスホトリエステル構造とを備えたオリゴヌクレオチドの製造方法。
【化学式1】


(上記一般式(1)中、R及びRはそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基であり、Rは水素原子、アルキル基又はアリール基である。また、上記一般式(1)で表される基は、波線を付した単結合により、酸素原子を介して亜リン酸基のリン原子に結合される。)

【請求項2】
前記一般式(1)で表される第一保護基を有するホスホアミダイド化合物が、下記一般式(2)で表されることを特徴とする請求項1記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【化学式2】


(上記一般式(2)において、R~Rは上記一般式(1)と同様であり、R及びRはそれぞれ独立にアルキル基であって、R及びRは互いに結合して環を形成してもよく、Nuはヌクレオシドの3’-末端に位置する水酸基から水素原子を除いた基を表す。)

【請求項3】
前記リンカーが、塩基性化合物に曝露されるのとは異なる手段により、生成したオリゴヌクレオチドを脱離させることを特徴とする請求項1又は2記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。

【請求項4】
前記リンカーが、光の照射を受けることにより、生成したオリゴヌクレオチドを脱離させることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。

【請求項5】
前記ホスホアミダイド化合物には二系統の化合物が含まれ、他の系統のホスホアミダイド化合物における保護基がメチル基である請求項1~4のいずれか1項記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2012068494thum.jpg
出願権利状態 審査請求前
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