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変異型RNAポリメラーゼβ-サブユニット遺伝子 コモンズ 新技術説明会

国内特許コード P130010112
掲載日 2013年11月29日
出願番号 特願2013-003150
公開番号 特開2013-162785
出願日 平成25年1月11日(2013.1.11)
公開日 平成25年8月22日(2013.8.22)
優先権データ
  • 特願2012-002943 (2012.1.11) JP
発明者
  • 田村 隆
出願人
  • 国立大学法人 岡山大学
発明の名称 変異型RNAポリメラーゼβ-サブユニット遺伝子 コモンズ 新技術説明会
発明の概要

【課題】rpoB遺伝子による二次代謝の調節メカニズムを解明し、細胞において二次代謝を活性化することのできる変異型rpoB遺伝子を提供し、ひいては二次代謝が活性化された放線菌等の細胞を提供する。
【解決手段】rpoB遺伝子に変異が導入された変異型rpoB遺伝子であり、rpoB遺伝子が特定のアミノ酸配列に相当する部位を含むRNAポリメラーゼβ-サブユニットをコードする遺伝子であり、前記変異が、前記アミノ酸配列内の2以上のアミノ酸の置換をもたらすものであり、前記変異によりRNAポリメラーゼの活性が増強する、変異型rpoB遺伝子。
【選択図】図1

従来技術、競合技術の概要


近年、病原性ウイルスの世界的、地域的流行が目立って頻発するようになってきている。現在処方可能な抗生物質のほとんどはウイルスには無効であり、感染拡大が始まればそれを押さえ込むのは容易ではない。ウイルス、原虫、がん細胞などに強い薬効を示す一群の抗生物質群が存在する。これらの抗生物質群は、核酸系抗生物質に分類され、遺伝情報の保存・発現を司るDNAやRNAの構成成分として知られるヌクレオシドやヌクレオチドの機能に関連する物質であり、優れた薬効を有することが知られている。しかしながら核酸系抗生物質は、放線菌等による生産量が極めて微量であり、工業的生産が困難であるため、社会的に活用されるに至っていない。



放線菌等のrpoB遺伝子への変異導入により、細胞内において二次代謝が活性化され、細胞内における物質の生産量が高められることが知られている。当該変異は、rpoB遺伝子のリファンピシン結合部位に導入されたものである(特許文献1、非特許文献1~4)。リファンピシンは抗生物質の一種であり、rpoBのリファンピシン結合部位に変異が見られる自然突然変異株がリファンピシンに対する耐性を獲得することが報告されている。



rpoBのリファンピシン結合部位の変異は、二次代謝の活性化を伴う。二次代謝の活性化のメカニズムとして、グアノシン4リン酸(ppGpp)結合状態の模倣が提唱されてきた。細菌は、タンパク質の原料であるアミノ酸が足りなくなってきた場合、ppGppを合成する。ppGppは、転写を担うRNAポリメラーゼと複合体をつくり、アミノ酸を増やすような役割、例えばリボソームRNA(rRNA)やトランスファーRNA(tRNA)の合成を抑制し、タンパク質合成を抑制したり、逆に、アミノ酸の生合成や輸送に必要なタンパク質の合成を促進したりすることが知られている。



しかしながら近年、rpoB遺伝子とppGppとの結晶構造モデルが報告され、ppGpp結合箇所とリファンピシン結合部位がかけはなれた位置にあることが分かった(非特許文献5)。rpoB遺伝子の二次代謝の調節のメカニズムはいまだ解明されないままとなっている。rpoB遺伝子の二次代謝調節メカニズムが明らかになれば、放線菌等の細胞における二次代謝の活性化を、戦略的かつ効率的に確立することができる。

産業上の利用分野


本発明は、変異型RNAポリメラーゼβ-サブユニット遺伝子(変異型rpoB遺伝子)、当該変異型rpoB遺伝子が導入された細胞、および当該細胞を用いて目的物質を産生する方法に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
rpoB遺伝子に変異が導入された変異型rpoB遺伝子であり、rpoB遺伝子が配列番号1に記載のアミノ酸配列に相当する部位を含むRNAポリメラーゼβ-サブユニットをコードする遺伝子であり、前記変異が、配列番号1に記載のアミノ酸配列内の2以上のアミノ酸の置換をもたらすものであり、前記変異によりRNAポリメラーゼの活性が増強する、変異型rpoB遺伝子(ただし、配列番号1における11番目のヒスチジンのアスパラギンへの置換と、14番目のアルギニンのセリンへの置換をもたらす変異が導入された変異型rpoB遺伝子を除く)。

【請求項2】
前記変異型rpoB遺伝子における変異が、配列番号1における1番目のアスパラギン酸、7番目のセリン、11番目のヒスチジン、14番目のアルギニン、57番目のイソロイシンに相当するアミノ酸から選択される2以上のアミノ酸の置換をもたらすものである、請求項1に記載の変異型rpoB遺伝子。

【請求項3】
請求項1または2に記載の変異型rpoB遺伝子が導入された、細胞。

【請求項4】
細胞が真正細菌である、請求項3に記載の細胞。

【請求項5】
細胞が放線菌である、請求項3または4に記載の細胞。

【請求項6】
相同組換えによりrpoB遺伝子に変異が導入された変異型rpoB遺伝子が導入された細胞を作製する方法であって、rpoB遺伝子が配列番号1に記載のアミノ酸配列に相当する部位を含むタンパク質をコードする遺伝子であり、変異型rpoB遺伝子における変異が、配列番号1に記載のアミノ酸配列内の2以上のアミノ酸の置換をもたらすものであり、相同組換えが、5'末端の塩基が欠損した変異型rpoB遺伝子を含有するベクターを用いて行われ、相同組換えの結果、細胞内の野生型rpoB遺伝子が破壊される、方法。

【請求項7】
請求項6に記載の方法により作製された細胞。

【請求項8】
請求項3~5および7のいずれか1に記載の細胞を用いて、目的物質を産生する方法。

【請求項9】
目的物質を、1のアミノ酸置換をもたらす変異が導入された変異型rpoB遺伝子を含む細胞に比べて、増大した量で産生しうる、請求項8に記載の産生方法。

【請求項10】
目的物質が、抗生物質である、請求項8または9に記載の産生方法。

【請求項11】
rpoB遺伝子に変異が導入された変異型rpoB遺伝子を細胞に形質転換し、得られた細胞から、1のアミノ酸置換をもたらす変異を含んでなる変異型rpoB遺伝子を含む細胞と比べて、目的物質の生産量が増大している細胞を選択する方法であって、
rpoB遺伝子が配列番号1に記載のアミノ酸配列に相当する部位を含むタンパク質をコードする遺伝子であり、変異型rpoB遺伝子における変異が、配列番号1に記載のアミノ酸配列内の2以上のアミノ酸の置換をもたらすものである、細胞を選択する方法。

【請求項12】
前記変異型rpoB遺伝子における変異が、配列番号1における1番目のアスパラギン酸、7番目のセリン、11番目のヒスチジン、14番目のアルギニン、57番目のイソロイシンに相当するアミノ酸から選択される2以上のアミノ酸の置換をもたらすものである、請求項11に記載の細胞を選択する方法。

【請求項13】
変異型rpoB遺伝子を含む細胞が、請求項7に記載の細胞である、請求項11または12に記載の細胞を選択する方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 審査請求前
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