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ATLLの診断のためのデータ取得方法、ATLL診断用キットおよびATLL診断システム コモンズ

国内特許コード P130010119
掲載日 2013年12月2日
出願番号 特願2013-026614
公開番号 特開2013-188208
出願日 平成25年2月14日(2013.2.14)
公開日 平成25年9月26日(2013.9.26)
優先権データ
  • 特願2012-029463 (2012.2.14) JP
発明者
  • 岡 剛史
  • 大内田 守
  • 吉野 正
出願人
  • 国立大学法人 岡山大学
発明の名称 ATLLの診断のためのデータ取得方法、ATLL診断用キットおよびATLL診断システム コモンズ
発明の概要

【課題】ATLL(成人T細胞白血病・リンパ腫)、特に高悪性型(急性型もしくはリンパ腫型)ATLLの発症を早期に高感度・高精度に診断することを可能にする手段を提供すること。
【解決手段】健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化CD4陽性T細胞(以下「(活性化)CD4陽性T細胞等」と表記する)、HTLV-I(ヒトT細胞白血病ウイルスI型)キャリアー由来のCD4陽性T細胞等、くすぶり型もしくは慢性型ATLL患者由来のCD4陽性T細胞等、あるいはHTLV-I感染し不死化したCD4陽性T細胞培養株またはATLL非腫瘍細胞由来CD4陽性T細胞培養株中の発現量を基準としたときに、くすぶり型もしくは慢性型ATLL患者から採取したCD4陽性T細胞等、急性型もしくはリンパ腫型ATLL患者から採取したCD4陽性T細胞等、あるいはATLL腫瘍細胞由来CD4陽性T細胞培養株中の発現量の当該基準に対する比率が、2倍以上または0.5倍以下であるmiRNAおよびこれらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のmiRNAについて、サンプル中の発現量を定量するステップを有することを特徴とする、ATLLの診断のためのデータ取得方法。
【選択図】なし

従来技術、競合技術の概要


ATLLは、その原因ウイルスであるHTLV-Iのキャリアーの中から日本で年間約700例が発症、キャリアー1000人あたりの年間ATLL発症率は男性で1.0~1.5人、女性で0.5~0.7人、30歳以上のキャリアーで生涯発症率は男性で4~7%、女性で2%台となる難治性の白血病・リンパ腫である。現在日本で約108万人、世界で約2000万人のキャリアーが存在する。



ATLLは、HTLV-IがCD4陽性T細胞に感染し、細胞-細胞間で感染し、長い潜伏期間の中で免疫機構から逃れたクローンが遺伝子異常、染色体異常、エピジェネティックな異常などを集積して、細胞を腫瘍化させることで発症すると考えられている。HTLV-Iのキャリアーの3~5%が、HTLV-I感染後40~60年してATLLを発症する。また、感染経路は主として母乳感染、輸血、性交である。



ATLLには、くすぶり型、慢性型、リンパ腫型および急性型の4つの病型が存在し、急性型およびリンパ腫型は治療抵抗性で、予後は極めて不良であるといわれている。実際、図1はある研究者により作成されたATLL患者の臨床病型別生存曲線であるが、この図を見ればわかるように、急性型およびリンパ腫型ATLLの患者の生存率は、観察開始から1年以内に50%以下にまで低下する。



このような難治性のATLLの従来の診断方法は、患者の末梢血における腫瘍細胞の同定の他、リンパ節腫脹、肝脾腫、高カルシウム血症などATLLに特異的な臨床症状を基準とするものである。しかし、このような方法では、特に急性型やリンパ腫型ATLLでは、発症し、症状が出始めた段階にならなければ診断ができず、それゆえ早期にこれらを診断することができないため、治療が手遅れになってしまう可能性がある。



ここで、特許文献1に示されるように、本発明者は、ATLLの予後を推定するためのデータの収集において、末梢血単核細胞(PBMC)の特定の遺伝子群について、それらの遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化状態を測定することにより、前記遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化プロファイルを作成するとともに、予後因子としてCIMPを算出し、メチル化遺伝子、メチル化遺伝子数及びCIMP値から算出されるATLL発症・進展危険度スコアによる危険度の階層化および/または特定の遺伝子のメチル化状態を表示することにより、HTLV-Iのキャリアーの発症またはindolent型(緩徐進行型)であるくすぶり型および慢性型ATLLがaggressive型(高悪性型)である急性型およびリンパ腫型ATLLへの進展を予測することを可能とするATLL予後推定用データを作成する方法を開発している。



ところで、マイクロRNA(miRNA)とは、19~25塩基程度のタンパク質をコードしないRNAであり、mRNAの3'非翻訳領域に結合し、リボソームにおける翻訳を阻害したり、mRNAを直接切断して、翻訳を阻害する。現在851種類のmiRNAがヒトで同定されており、1つのmiRNAが100個以上の遺伝子(由来のmRNA)を標的としている。



このようなmiRNAは、通常細胞では適切な量が作られており、標的mRNAの翻訳を阻害し、幹細胞の維持、細胞増殖や発生・分化、細胞死といった細胞の生命現象を適切に制御していると考えられている(非特許文献1参照)。実際、あるmiRNAが大腸癌に関連することが知見されている(非特許文献2参照)。

産業上の利用分野


本発明は、ヒトT細胞白血病ウイルスI型(human T-cell leukemia virus I、HTLV-I)キャリアーが成人T細胞白血病・リンパ腫(Adult T cell leukemia/lymphoma, ATLL)、特に高悪性型ATLLを発症するのを早期に診断するためなどに有用な、ATLLの診断のためのデータ取得方法、および当該方法を実施するためのキットおよびシステムに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化CD4陽性T細胞、HTLV-I(ヒトT細胞白血病ウイルスI型)キャリアー由来の末梢血、末梢血単核球またはCD4陽性T細胞、くすぶり型もしくは慢性型ATLL(成人T細胞白血病・リンパ腫)患者由来の末梢血、末梢血単核球またはCD4陽性T細胞、あるいはHTLV-I感染し不死化したCD4陽性T細胞培養株またはATLL非腫瘍細胞由来CD4陽性T細胞培養株中の発現量を基準としたときに、
くすぶり型もしくは慢性型ATLL患者から採取した末梢血、末梢血単核球またはCD4陽性T細胞、急性型もしくはリンパ腫型ATLL患者から採取した末梢血、末梢血単核球またはCD4陽性T細胞、あるいはATLL腫瘍細胞由来CD4陽性T細胞培養株中の発現量の当該基準に対する比率が、2倍以上または0.5倍以下であるmiRNAおよびこれらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種の定量対象miRNAについて、
サンプル中の発現量を定量するステップを有することを特徴とする、ATLLの診断のためのデータ取得方法。

【請求項2】
前記定量対象miRNAが、
hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182、hsa-miR-660、hsa-let-7b、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-342、hsa-miR-148a、hsa-miR-133b、hsa-miR-210、hsa-miR-486、hsa-miR-362、hsa-miR-210、hsa-miR-27a、hsa-miR-551b、hsa-miR-625、hsa-miR-183、hsa-miR-23a、hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-525*、hsa-miR-124a、hsa-miR-200c、ebv-miR-BART20-3p、hsa-miR-630、hsa-miR-223、hsa-miR-22、hsa-miR-26a、hsa-miR-768-5p;
hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-490、hsa-miR-100、hsa-miR-571、hsa-miR-296、hsa-miR-9*、hsa-miR-196a、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-15b、hsa-miR-10a、hsa-miR-484、hsa-let-7c、hsa-miR-16、hsa-miR-193b、hsa-miR-15a、hsa-miR-301、hsa-miR-320、hsa-miR-196b、hsa-miR-107、hsa-miR-195、hsa-miR-103、hsa-miR-186、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-365、hsa-miR-490、hsa-miR-550、hsa-miR-183、hsa-miR-182、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-663、hsa-miR-422b、hsa-miR-345、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-96、hsa-miR-193a、hsa-let-7d、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-339、hsa-miR-155、hsa-let-7a;および
これらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のmiRNAである、請求項1に記載のデータ取得方法。

【請求項3】
前記定量対象miRNAが、
hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182、hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-525*、hsa-miR-124a、hsa-miR-342;
hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-9*、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-365、hsa-miR-100、hsa-miR-9;および
これらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のmiRNAである、請求項1に記載のデータ取得方法。

【請求項4】
前記定量対象miRNAが、
hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-486、hsa-miR-124a、hsa-miR-525*、hsa-miR-150、hsa-miR-363;
hsa-miR-296、hsa-miR-15b、hsa-miR-484、hsa-miR-16、hsa-miR-195、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-550、hsa-miR-422b;および
これらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のmiRNAである、請求項1に記載のデータ取得方法。

【請求項5】
hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182、hsa-miR-660、hsa-let-7b、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-342、hsa-miR-148a、hsa-miR-133b、hsa-miR-210、hsa-miR-486、hsa-miR-362、hsa-miR-210、hsa-miR-27a、hsa-miR-551b、hsa-miR-625、hsa-miR-183およびhsa-miR-23aからなる群より選ばれる少なくとも一種のmiRNAについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
HTLV-Iキャリアー由来の末梢血、末梢血単核球またはCD4陽性T細胞、あるいはそのモデルとしてのHTLV-I感染し不死化したCD4陽性T細胞培養株中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、0.5倍以下であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、請求項1に記載のATLLの診断のためのデータ取得方法。

【請求項6】
hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-34a、hsa-miR-525*、hsa-miR-146b、hsa-miR-146a、hsa-miR-222、hsa-miR-221、hsa-miR-124a、hsa-miR-34b、hsa-miR-125a、hsa-miR-342、hsa-miR-200c、ebv-miR-BART20-3p、hsa-miR-625、hsa-miR-630、hsa-miR-223、hsa-miR-660、hsa-let-7b、hsa-miR-582、hsa-miR-22、hsa-miR-26aおよびhsa-miR-768-5pからなる群より選ばれる少なくとも一種のmiRNAについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化CD4陽性T細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、0.5倍以下であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、請求項1に記載のATLLの診断のためのデータ取得方法。

【請求項7】
hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-490、hsa-miR-100、hsa-miR-571、hsa-miR-296、hsa-miR-9*、hsa-miR-196a、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-15b、hsa-miR-10a、hsa-miR-484、hsa-let-7c、hsa-miR-16、hsa-miR-193b、hsa-miR-15a、hsa-miR-301、hsa-miR-320、hsa-miR-196b、hsa-miR-107、hsa-miR-195、hsa-miR-103、hsa-miR-186およびhsa-miR-769-5pからなる群より選ばれる少なくとも一種のmiRNAについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
HTLV-Iキャリアー由来の末梢血、末梢血単核球またはCD4陽性T細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、2倍以上であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、請求項1に記載のATLLの診断のためのデータ取得方法。

【請求項8】
hsa-miR-9*、hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-365、hsa-miR-100、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-490、hsa-miR-196b、hsa-miR-550、hsa-let-7c、hsa-miR-571、hsa-miR-183、hsa-miR-182、hsa-miR-320、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-296、hsa-miR-663、hsa-miR-422b、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-301、hsa-miR-345、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-96、hsa-miR-193a、hsa-let-7d、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-339、hsa-miR-152、hsa-miR-155およびhsa-let-7aからなる群より選ばれる少なくとも一種のmiRNAについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化CD4陽性T細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、2倍以上であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、請求項1に記載のATLLの診断のためのデータ取得方法。

【請求項9】
前記ATLLの診断のためのデータが、少なくとも急性型ATLLの診断のためのデータを含むものである、請求項1~8のいずれかに記載のデータ取得方法。

【請求項10】
hsa-miR-34aについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化CD4陽性T細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、0.5倍以下であるかどうかを判定するステップを有し、
急性型ATLL、くすぶり型ATLLまたはその両方の診断のためのデータを取得することを特徴とする、
請求項1に記載のATLLの診断のためのデータ取得方法。

【請求項11】
hsa-miR-99aまたはhsa-miR-125bについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化CD4陽性T細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、2倍以上であるかどうかを判定するステップを有し、
急性型ATLL、くすぶり型ATLLまたはその両方の診断のためのデータを取得することを特徴とする、請求項1に記載のATLLの診断のためのデータ取得方法。

【請求項12】
前記定量対象miRNAを定量RT-PCR法により定量する、請求項1~11のいずれかに記載のデータ取得方法。

【請求項13】
請求項1~12のいずれかに記載のデータ取得方法において定義される前記定量対象miRNAを定量するためのキットであって、少なくとも当該定量対象miRNAを増幅するためのプライマーを内容物に含むことを特徴とする、ATLL診断用キット。

【請求項14】
請求項1~12のいずれかに記載のデータ取得方法において定義される前記定量対象miRNAについて、サンプル中の発現量を定量する定量手段と、
前記miRNAについての基準となる発現量および発現量比率の条件を記録した記録手段と、
前記定量手段により得られた定量対象miRNAの発現量の測定データを、前記記録手段に記録された定量対象miRNAの発現量の基準データと比較し、当該定量対象miRNAの発現量比率の条件を満たす場合、前記サンプルはくすぶり型もしくは慢性型ATLL患者由来のもの、または急性型もしくはリンパ腫型ATLL患者由来のものであると判定し、それ以外の場合には、前記サンプルは健常者、HTLV-Iキャリアー、または前記の型以外のATLL患者由来のものであると判定する判定手段と、
前記判定手段の判定結果を出力する出力手段と
を備えることを特徴とする、ATLL診断システム。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 審査請求前
特許内容に関しての問い合せ窓口は岡山大学連携機構知的財産部門です。

技術移転に関しては岡山TLOが窓口になります。


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