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蛍光プローブ及び検出方法 コモンズ

国内特許コード P140010368
整理番号 NU-0527
掲載日 2014年2月28日
出願番号 特願2013-239263
公開番号 特開2015-098457
出願日 平成25年11月19日(2013.11.19)
公開日 平成27年5月28日(2015.5.28)
発明者
  • 本多 裕之
  • 大河内 美奈
  • 杉田 智哉
出願人
  • 国立大学法人名古屋大学
発明の名称 蛍光プローブ及び検出方法 コモンズ
発明の概要 【課題】迅速、簡便且つ高感度で標的分子を検出することができる、新規構造の蛍光プローブを提供することを課題とする。
【解決手段】蛍光色素が結合したペプチドと、クエンチャーが結合した相補ペプチドがリンカーで結合された構造を備えた蛍光プローブが提供される。標的分子が結合していない状態では二つのペプチドの間で閉じた構造が形成されて蛍光色素とクエンチャーが近接し、光誘起電子移動の原理で消光が誘導される。標的分子が結合すると蛍光色素が蛍光を発する。
【選択図】図3
従来技術、競合技術の概要



生物医学研究や診断技術において、簡易かつ高感度に目的のタンパク質を検出する技術が求められている。特に抗体量を検出する技術は、HIVやガンなどといった病気の簡易診断や抗体医薬生産における抗体産生細胞セレクションなどへの応用が期待される。現在、最も広く使われている手法はELISA法である。ELISAは、補足抗体を固定化させ、抗原を添加、その後、検出抗体と発色基質を用いることで検出する方法であり、利点としては、高い特異性、高感度ということが挙げられる。しかしながら、ELISA法は、固相表面が反応場である異相系(固相-液相)反応(ヘテロジーニアス系)であるため、目的抗体を補足するための抗体やそれらの結合時間、またサンプル中の夾雑物を取り除くための洗浄操作が必要である。そのため、より短時間で、洗浄操作を必要としない抗体量を測定する方法が求められている。この要望に応えるべく、本発明者らの研究グループは、迅速かつ簡便な検出法となり得る、ホモジーニアスな抗体検出技術の開発を目指し、精力的な研究を行ってきた。その成果として、IgG抗体のFc領域に高結合するペプチド(Fペプチド)の取得に成功した(2012年3月15日、化学工学会 第77年会で発表)。また、トリプトファンの持つ光誘起電子移動(PeT: Photo-induced Electron Transfer)作用に注目し、Fペプチドに相補的なペプチドにトリプトファンを付加したクエンチペプチド(Qペプチド)を設計し、蛍光標識したFペプチドとQペプチドの相互作用を利用した蛍光検出法を報告した(2012年11月11日、第43回中部化学関係学協会支部連合秋季大会で発表)。この蛍光検出法では、標的分子であるIgG抗体が非存在下ではFペプチドとQペプチドが相互作用することにより消光が誘導される(図15)。一方、IgG抗体の存在下ではFペプチドとQペプチドの相互作用が阻害され、消光が誘導されず、蛍光を発したままとなる。従って、蛍光強度を検出することにより、抗体量を測定することが可能となる。尚、ペプチドを利用した蛍光検出法に関する過去の報告を以下に示す(特許文献1~3、非特許文献1、2)。

産業上の利用分野



本発明は蛍光プローブ及びその用途に関する。詳しくは標的分子特異的ペプチドを用いた蛍光プローブ及び検出方法等に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
標的分子特異的な結合性を示し、その片方の末端に蛍光色素が結合した第1ペプチドと、該第1ペプチドに相補的であり、その片方の末端にクエンチャーが結合した第2ペプチドと、がリンカーで連結された構造を備え、
前記リンカーは、前記第1ペプチドの前記蛍光色素が結合していない末端と、前記第2ペプチドの前記クエンチャーが結合していない末端とを連結しており、
前記第1ペプチドが標的分子に結合していないときに、前記第1ペプチドと前記第2ペプチドの間で閉じた構造が形成されて前記蛍光色素と前記クエンチャーが近接し、光誘起電子移動の原理で消光が誘導され、
前記第1ペプチドが標的分子に結合したときに前記蛍光色素が蛍光を発する、蛍光プローブ。

【請求項2】
前記クエンチャーが1又は数個のトリプトファンを含む、請求項1に記載の蛍光プローブ。

【請求項3】
前記クエンチャーに含まれるトリプトファンの数が1~5個である、請求項2に記載の蛍光プローブ。

【請求項4】
前記クエンチャーが、1又は数個のグリシンからなるスペーサーを介して前記第2ペプチドに結合している、請求項2又は3に記載の蛍光プローブ。

【請求項5】
前記第1ペプチドがIgG特異的な結合性を示す、請求項1~4のいずれか一項に記載の蛍光プローブ。

【請求項6】
前記第1ペプチドがアミノ酸配列NKFRGKYK(配列番号1)を含む、請求項5に記載の蛍光プローブ。

【請求項7】
前記第2ペプチドがアミノ酸配列NWYVDGVE(配列番号2)又はDIAVEWES(配列番号3)を含む、請求項6に記載の蛍光プローブ。

【請求項8】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項1~7のいずれか一項に記載の蛍光プローブ。

【請求項9】
前記ペプチドリンカーがグリン及びセリンから構成される、請求項8に記載の蛍光プローブ。

【請求項10】
前記蛍光色素が、前記第1ペプチドのN末端に結合している、請求項1~9のいずれか一項に記載の蛍光プローブ。

【請求項11】
アミノ酸配列NKFRGKYKGGSGGSDIAVEWESGWWWW(配列番号7)を含む、請求項1に記載の蛍光プローブ。

【請求項12】
請求項1~11のいずれか一項に記載の蛍光プローブを用いることを特徴とする、検出方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 公開
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