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組み換えヒト膵臓リパーゼの調製方法 コモンズ 新技術説明会

国内特許コード P140010584
整理番号 12-0107
掲載日 2014年5月30日
出願番号 特願2012-263442
公開番号 特開2014-108073
登録番号 特許第6086378号
出願日 平成24年11月30日(2012.11.30)
公開日 平成26年6月12日(2014.6.12)
登録日 平成29年2月10日(2017.2.10)
発明者
  • 小川 温子
  • 相川 京子
  • 富田 千尋
  • 楢舘 里奈
  • 樋上 智子
出願人
  • 国立大学法人お茶の水女子大学
発明の名称 組み換えヒト膵臓リパーゼの調製方法 コモンズ 新技術説明会
発明の概要 【課題】天然ブタ膵リパーゼに近い比活性をもつ組換えヒト膵臓リパーゼ(recHPL)を大量に調製する方法を提供すること。
【解決手段】(a)HPL cDNAに、Strep-tagIIをC末側に付加した発現プラスミドを構築する工程;(b)構築した発現プラスミドを大腸菌に導入した後に培養して、大腸菌内にHPLを発現させる工程;(c)前記大腸菌を破砕した大腸菌溶解物から、ストレプタクチンを担持したセファロースを用いてHPLをワンステップで精製する工程;及び(d)精製したHPLを、Ca2+添加し尿素濃度を段階的に低下させるグリセロール段階透析法を用いて活性化するリフォールディング工程;の各工程を順次備えるrecHPLの調製方法とする。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要



ヒト膵リパーゼ(E.C.3.1.1.3.)は、膵腺房細胞で合成され膵液中に分泌される分子量約4万8千の糖タンパク質である。膵リパーゼはトリグリセリドのα位脂肪酸エステルを加水分解し、ジグリセリド成分と遊離の脂肪酸へ分解する。





ヒト膵リパーゼの大量発現法としては、昆虫細胞sf6を用いて発現させる方法(例えば、非特許文献1参照)、チャイニーズハムスター由来細胞V79を用いて発現させる方法(例えば、非特許文献2参照)、酵母を用いて発現させる方法(例えば、非特許文献3参照)が知られている。しかし、これらの方法はいずれもコストが非常にかかる上、発現に6~10日間を要する。また、いずれの方法においても、リパーゼにヒト型ではない糖鎖が修飾される場合があるため、ヒトがこれらリパーゼを摂取するとアレルギーが引き起こされたり、生体内での安定性が変わる可能性があり、安全性に乏しいと言える。このため、より短期間で発現でき、かつ糖鎖の修飾が起こらない、大腸菌を用いた大量発現方法の開発が求められている。





他方、大腸菌を用いてリパーゼを発現させる方法としては、ジオバチルス属の耐熱性T1リパーゼをGSTタグを組み込んだ融合タンパクとして発現させる方法(例えば、特許文献1参照)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の成熟リパーゼ(SAL3)を、N末端側にHisタグを組み込んだ融合タンパクとして発現させる方法(例えば、非特許文献4参照)、Candida antarctica由来のリパーゼを、N末端側にFLAGタグ、あるいはC末端側にHisタグを組み込んだ融合タンパクとしてそれぞれ発現させる方法(例えば、非特許文献5参照)、Ralstonia sp.M1由来のリパーゼを、Hisタグを組み込んだ融合タンパクとして発現させる方法(例えば、非特許文献6参照)が知られている。また、デンプン結合性タンパク質(SBP)タグを使用する、大腸菌で発現した組換えリパーゼの精製方法(例えば、特許文献2参照)も知られている。これらタグ付きリパーゼにはいずれも酵素活性がみられているが、大量発現系の確立には至っておらず、また、微生物由来のリパーゼとは構造の異なるヒト型リパーゼを大腸菌で発現させる方法については一切考慮されていない。

産業上の利用分野



本発明は、組換えヒト膵臓リパーゼ(recHPL)の調製方法、より詳しくは、C末側にStrep-tagIIを付加して精製したHPLを、段階透析法を利用してリフォールディングするrecHPLの調製方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
a)ヒト膵臓リパーゼ(HPL)のcDNAに、Strep-tagIIをC末側に付加した発現プラスミドを構築する工程;
(b)構築した発現プラスミドを大腸菌に導入した後に培養して、大腸菌内にHPLを発現させる工程;
(c)前記大腸菌を破砕した大腸菌溶解物から、ストレプタクチンを担持したセファロースを用いてHPLをワンステップで精製する工程;及び、
(d)精製したHPLを、グリセロール添加段階透析法を用いて活性化するリフォールディング工程;
を備え、
前記グリセロール添加段階透析法が、10%グリセロール及び2.5~5mM Ca2+を添加し、酸化剤/還元剤としてシスチン/システインを用い、及び、尿素濃度を8Mから0Mに段階的に低下させるグリセロール添加段階透析法であることを特徴とする組換えヒト膵臓リパーゼ(recHPL)の調製方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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