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複素環化合物、金属錯体及び蛍光プローブ コモンズ 外国出願あり

国内特許コード P140010769
整理番号 DP1548,S2012-0829-N0
掲載日 2014年7月17日
出願番号 特願2012-186647
公開番号 特開2014-043417
登録番号 特許第5512764号
出願日 平成24年8月27日(2012.8.27)
公開日 平成26年3月13日(2014.3.13)
登録日 平成26年4月4日(2014.4.4)
発明者
  • 人見 穣
  • 武安 俊幸
出願人
  • 学校法人同志社
発明の名称 複素環化合物、金属錯体及び蛍光プローブ コモンズ 外国出願あり
発明の概要 【課題】水中でも安定しているため、生体試料の測定にも使用可能であり、かつ、従来からあるものよりも反応速度が速い過酸化水素検出用蛍光プローブ、プローブの構成要素である金属錯体、金属錯体の配位子である複素環化合物を提供する。
【解決手段】この発明の複素環化合物は下式(I)で表される。



(式中、Xanはキサンテン系色素であり、nは0~6であり、R1は水素原子、メチル基であり、R2、R3及びR6は水素原子であり、R4は水素原子、メチル基、塩素原子、メトキシ基、ニトロ基であり、R5は水素原子、メトキシ基、エトキシカルボニルメチルエーテル基(OCH2CO2CH2CH3)であり、R7 及びR9はそれぞれ独立して水素原子、メチル基、メトキシ基であり、R8は水素原子、メチル基、塩素原子、メトキシ基、ニトロ基であり、R10は水素原子、メチル基、塩素原子、フッ素原子である。)
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要



近年、生体内での過酸化水素などの活性酸素種の発生による細胞の酸化ストレスが、癌やパーキンソン病などの神経疾患と関連していることが明らかになってきている。また、活性酸素種が情報伝達物質として働く、具体的には、循環器系などで血圧を制御する、など多様な生理作用を発揮していることが知られている。これら疾患の病因、病態や作用機序を解明するため、生体内における過酸化水素の発生をダイナミックに解析することが求められている。





このような活性酸素種をダイナミックに解析するためには、蛍光プローブを使用するバイオイメージング法が主に利用されている。そして、過酸化水素に対する蛍光プローブとしては、従来から「炭素-ホウ素の酸化的開裂によって蛍光強度が増大する分子」などが使用されてきている(特許文献1~2、非特許文献1~10を参照。)。





しかし、前記分子を過酸化水素検出用の蛍光プローブに使用すると、反応開始から蛍光強度が最大強度に達するまでに約100分かかり、最大値の半分の強度に達するまでに約22分かかってしまう。そのため、前記分子を蛍光プローブとして使用しても、過酸化水素の発生や消滅をタイミングよく、ダイナミックに検出することはできなかった。





一方、酸化還元酵素が基質を酸化する際に過酸化水素が生じる反応、例えば、グルコースオキシダーゼがβ-D-グルコースをグルコノラクトンに酸化する反応、が既に知られている。そして、この知見とレゾルフィン系複素環式化合物からなる過酸化水素検出用蛍光プローブとを組み合わせて、サンプル中の生体分子の濃度を測定する方法が開発されている。なお、この方法に使用する測定キット、例えば、Amplex Red(登録商標)Assay Kit(Invitrogen製)も既に販売されている(非特許文献11を参照。)。





この測定方法では、サンプル中の生体分子から酸化還元酵素によって過酸化水素を発生させたのち、発生した過酸化水素と蛍光プローブとをペルオキシダーゼの存在下で反応させ、その蛍光量を測定することによって、間接的に測定している。また、この蛍光プローブは、過酸化水素だけでは蛍光せず、ペルオキシダーゼと過酸化水素によって生じる強酸化物によって蛍光する。





そのため、この測定方法には、酸化還元酵素の基質特異性、ペルオキシダーセの基質特性に大きく依存し、過酸化水素濃度を直接測定できないため、サンプル中の阻害剤により影響を受け易いとの問題点があった。





発明者らは、これら従来技術の問題点を解決するため、非特許文献11に記載の複素環式化合物と、遷移金属からなる中心金属に含窒素配位子が三座配位してなる金属錯体とがアミド結合してなる化合物を既に合成している。ただ、この化合物は耐水性が低く、水中で利用できないため、過酸化水素の検出には利用できないとの問題点があった(非特許文献12及び非特許文献13を参照。)。





そこで、発明者らは、これらの問題を解決するため研究をさらに進め、金属錯体に蛍光色素がアミド結合した金属錯体(以下、MBFh1と省略する。)を合成するとともに、このMBFh1を含む過酸化水素蛍光プローブが水中の過酸化水素を検出できること、その水中における反応速度が従来からある「炭素-ホウ素の酸化的開裂によって蛍光強度が増大する分子」よりも速いこと、を確認した(特許文献3及び非特許文献14を参照。)。





しかし、MBFh1は、アミド部位を含む蛍光団部位を含んでいるため、それ自体が弱い蛍光を放ち、水中での安定性も不十分であった。そのため、MBFh1には、多様な活性酸素種を含む生体試料、例えば細胞や組織の測定には使用できないとの問題点があった。

産業上の利用分野



この発明は、複素環化合物、これを配位子として含む金属錯体、及びこの金属錯体を使用して過酸化水素を検出する蛍光プローブなどに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
下記一般式(I)で表される複素環化合物。
【化1】


(式中、Xanはキサンテン系色素であり、nは0~6であり、R1は水素原子、メチル基であり、R2、R3及びR6は水素原子であり、R4は水素原子、メチル基、塩素原子、メトキシ基、ニトロ基であり、R5は水素原子、メトキシ基、エトキシカルボニルメチルエーテル基(OCH2CO2CH2CH3)であり、R7 及びR9はそれぞれ独立して水素原子、メチル基、メトキシ基であり、R8は水素原子、メチル基、塩素原子、メトキシ基、ニトロ基であり、R10は水素原子、メチル基、塩素原子、フッ素原子である。)

【請求項2】
下記一般式(II)で表される請求項1に記載の複素環化合物。
【化2】


(RXはそれぞれ独立して水素原子、塩素原子、フッ素原子であり、nは0~6である。)

【請求項3】
Rxが水素原子であり、n=1である請求項2に記載の複素環化合物。

【請求項4】
下記一般式(III)で表される金属錯体。
【化3】


(式中、Xanはキサンテン系色素であり、nは0~6であり、R1は水素原子、メチル基であり、R2、R3及びR6は水素原子であり、R4は水素原子、メチル基、塩素原子、メトキシ基、ニトロ基であり、R5は水素原子、メトキシ基、エトキシカルボニルメチルエーテル基(OCH2CO2CH2CH3)であり、R7 及びR9はそれぞれ独立して水素原子、メチル基、メトキシ基であり、R8は水素原子、メチル基、塩素原子、メトキシ基、ニトロ基であり、R10は水素原子、メチル基、塩素原子、フッ素原子であり、Mは鉄、マンガン、コバルト、ニッケル、銅、ルテニウムであり、Lは塩素イオン、臭素イオン、硝酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオンである。)

【請求項5】
下記一般式(IV)で表される請求項4に記載の金属錯体。
【化4】


(式中、RXはそれぞれ独立して水素原子、塩素原子、フッ素原子であり、nは0~6であり、Mは鉄、マンガン、コバルト、ニッケル、銅、ルテニウムであり、Lは塩素イオン、臭素イオン、硝酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオンである。)

【請求項6】
Rxが水素原子、Lが塩素イオン、n=1である請求項5に記載の金属錯体。

【請求項7】
請求項4~6の何れかに記載の金属錯体を含む蛍光プローブ。

【請求項8】
過酸化水素の検出に使用する請求項7に記載の蛍光プローブ。

【請求項9】
請求項7に記載の蛍光プローブを含むバイオアッセイ用キット。

【請求項10】
請求項7に記載の蛍光プローブを含むバイオイメージング用キット。

【請求項11】
請求項7に記載の蛍光プローブを含む臨床分析用キット。

【請求項12】
請求項7に記載の蛍光プローブで標識した標識抗体。

【請求項13】
請求項12に記載の標識抗体を含むバイオアッセイ用キット。

【請求項14】
請求項12に記載の標識抗体を含むバイオイメージング用キット。

【請求項15】
請求項12に記載の標識抗体を含む臨床分析用キット。
産業区分
  • 試験、検査
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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