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核内から細胞質へのターゲットmRNAの輸送を促進する方法、タンパク質の発現方法および製造方法、ならびに、それに用いるキット 実績あり

国内特許コード P140010875
整理番号 3816,S2012-0645-N0
掲載日 2014年8月11日
出願番号 特願2012-165287
公開番号 特開2014-023459
出願日 平成24年7月26日(2012.7.26)
公開日 平成26年2月6日(2014.2.6)
発明者
  • 増田 誠司
出願人
  • 国立大学法人京都大学
発明の名称 核内から細胞質へのターゲットmRNAの輸送を促進する方法、タンパク質の発現方法および製造方法、ならびに、それに用いるキット 実績あり
発明の概要 【課題】 真核細胞におけるタンパク質の生産性を向上するための新たな方法を提供する。
【解決手段】 真核細胞においてターゲットタンパク質を発現させるにあたって、下記(A1)工程および下記(A2)工程の少なくとも一方の工程を行うことで、核内から細胞質への前記ターゲットmRNAの輸送を促進する。これによって、核内で転写されたターゲットmRNAの細胞質への輸送が促進されるため、細胞質における前記ターゲットタンパク質の発現が向上する。
(A1)前記真核細胞において、前記ターゲットmRNAとMS2結合配列とを含む融合RNA(X1)、および、MS2とTAPとを含む融合タンパク質(Y1)を発現させる工程
(A2)前記真核細胞において、前記ターゲットmRNAとRREとを含む融合RNA(X2)、および、Revを含むタンパク質(Y2)を発現させる工程
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要



医療分野等で利用される有用性の高いタンパク質の多くが、活性のために、糖鎖修飾やジスルフィド結合等の翻訳後修飾を必要としている。このため、工業的に前記有用タンパク質を生産するには、大腸菌等の微生物ではなく、真核細胞、特に動物細胞を宿主として利用し、組換えタンパク質として発現させる方法が一般的である。





しかしながら、真核細胞を宿主として使用した場合、微生物と比較して生産性が低いという問題がある。そこで、真核細胞による生産性を向上する方法として、転写を強力に誘導するプロモーターを使用して、mRNAの転写量を増加させる方法が報告されている。具体的には、前記プロモーターとして、サイトメガロウイルスのプロモーター(CMVプロモーター)および転写伸長因子1αのプロモーター等が利用されている(非特許文献1および2)。





しかしながら、このような改良によっても、動物細胞等の真核細胞におけるタンパク質の生産性は、十分とはいえず、さらなる改善が望まれている。

産業上の利用分野



本発明は、核内から細胞質へのターゲットmRNAの輸送を促進する方法、タンパク質の発現方法および製造方法、ならびに、それに用いるキットに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
真核細胞において、核内から細胞質へのターゲットmRNAの輸送を促進する方法であって、
下記(A1)工程および下記(A2)工程の少なくとも一方の工程を有することを特徴とするmRNA輸送促進方法。
(A1)前記真核細胞において、前記ターゲットmRNAとMS2結合配列とを含む融合RNA(X1)、および、MS2とTAPとを含む融合タンパク質(Y1)を発現させる工程
(A2)前記真核細胞において、前記ターゲットmRNAとRREとを含む融合RNA(X2)、および、Revを含むタンパク質(Y2)を発現させる工程
【請求項2】
前記(A1)工程の前記融合RNA(X1)において、前記MS2結合配列の個数が、2個以上である、請求項1記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項3】
前記(A1)工程の前記融合RNA(X1)において、2個以上の前記MS2結合配列が連結している、請求項1または2記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項4】
前記(A1)工程の前記融合RNA(X1)が、前記ターゲットmRNAの5’側に、前記MS2結合配列を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項5】
前記(A1)工程において、前記真核細胞に、前記融合RNA(X1)を発現する核酸分子(x1)を導入して、前記融合RNA(X1)を発現させる、請求項1から4のいずれか一項に記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項6】
前記(A1)工程において、前記真核細胞が、前記融合タンパク質(Y1)を発現する形質転換体である、請求項5記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項7】
前記真核細胞に、前記融合タンパク質(Y1)を発現する核酸分子(y1)を導入して、前記融合タンパク質を発現させる、請求項5記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項8】
前記(A2)工程の前記融合RNA(X2)が、前記ターゲットmRNAの5’側に、前記RREを有する、請求項1記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項9】
前記(A2)工程の前記タンパク質(Y2)が、Revを含む融合タンパク質である、請求項1または8記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項10】
前記(A2)工程において、前記真核細胞に、前記融合RNA(X2)を発現する核酸分子(x2)を導入して、前記融合RNA(X2)を発現させる、請求項1、8および9のいずれか一項に記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項11】
前記(A2)工程において、前記真核細胞が、前記タンパク質(Y2)を発現する形質転換体である、請求項10記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項12】
前記(A2)工程において、前記真核細胞に、前記タンパク質(Y2)を発現する核酸分子(y2)を導入して、前記タンパク質を発現させる、請求項10記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項13】
前記真核細胞が、動物細胞である、請求項1から12のいずれか一項に記載のmRNA輸送促進方法。
【請求項14】
真核細胞におけるターゲットタンパク質の発現方法であって、
請求項1から13のいずれか一項に記載のmRNAの輸送促進方法によって、前記ターゲットタンパク質をコードするターゲットmRNAを細胞核から細胞質に輸送させ、前記細胞質において、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項15】
真核細胞を用いたターゲットタンパク質の製造方法であって、
請求項14記載の発現方法により、前記ターゲットタンパク質を発現させることを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項16】
請求項1から13のいずれか一項に記載のターゲットmRNAの輸送促進方法に使用するキットであって、下記(a1)および下記(a2)の少なくとも一方を含むことを特徴とするmRNAの輸送促進用キット。
(a1)ターゲットmRNAとMS2結合配列とを含む融合RNA(X1)を発現する核酸分子(x1)、および、MS2とTAPとを含む融合タンパク質(Y1)を発現する核酸分子(y1)
(a2)ターゲットmRNAとRREとを含む融合RNA(X2)を発現する核酸分子(x2)、および、Revを含むタンパク質(Y2)を発現する核酸分子(y2)
【請求項17】
請求項1から13のいずれか一項に記載のターゲットmRNAの輸送促進方法に使用するキットであって、下記(a1’)および下記(a2’)の少なくとも一方を含むことを特徴とするmRNAの輸送促進用キット。
(a1’)ターゲットmRNAとMS2結合配列とを含む融合RNA(X1)を発現する核酸分子(x1)、および、MS2とTAPとを含む融合タンパク質(Y1)を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体
(a2’)ターゲットmRNAとRREとを含む融合RNA(X2)を発現する核酸分子(x2)、および、Revを含むタンパク質(Y2)を発現するように形質転換した真核細胞の組換え体
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開
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