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コア物質への糖鎖付加方法

国内特許コード P140010934
掲載日 2014年8月26日
出願番号 特願2006-338914
公開番号 特開2008-150464
登録番号 特許第4982852号
出願日 平成18年12月15日(2006.12.15)
公開日 平成20年7月3日(2008.7.3)
登録日 平成24年5月11日(2012.5.11)
発明者
  • 山口 真範
出願人
  • 国立大学法人弘前大学
発明の名称 コア物質への糖鎖付加方法
発明の概要 【課題】 グリコサミノグリカン糖鎖などの糖鎖をコアタンパク質などのコア物質に、その水溶性に左右されることなく高効率的に付加する方法を提供すること。
【解決手段】 少なくとも以下の3つの工程を含んでなることを特徴とする。
工程A: キシロシルセリン結合(Xyl-Ser)を有する糖タンパク質および/またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド-β-キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程。
工程B: コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程。
工程C: 工程Aで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Bで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程。
【選択図】 なし
従来技術、競合技術の概要



遺伝子工学の進歩に伴い、外来遺伝子を組み込んだ大腸菌に異種タンパク質を生産させることは今や困難なことではない。しかしながら、真核生物が生産するタンパク質は大半のものが糖鎖の付加を伴うのに対し、大腸菌が生産するタンパク質は糖鎖の付加を伴わないため、真核生物に大腸菌が生産したタンパク質を投与した場合、そのタンパク質には糖鎖が付加されていないことに起因して、真核生物が生産するタンパク質とは違って十分な機能を示さないといった現象や生体内における安定性に欠けるといった現象が見られることがある。このような問題を解決するために、糖鎖を持つタンパク質を動物細胞に生産させることも行われているが、動物細胞を用いた異種タンパク質の生産は大腸菌を用いたそれよりも困難であったりコストが高くついたりするのが一般的である。従って、大腸菌が生産するタンパク質のように糖鎖を持たない物質に糖鎖を付加する方法がこれまでにも検討されている。例えば特許文献1では、プロテオグリカンのコアタンパク質とグリコサミノグリカン糖鎖の結合部位にあるキシロシルセリン結合(Xyl-Ser)に作用する糖加水分解酵素であるエンド-β-キシロシダーゼを用いた糖鎖転移反応を利用して人工的にプロテオグリカンを合成する方法が提案されており、その実施例では、もとのプロテオグリカンにあったグルコサミノグリカン糖鎖を人工ペプチドに転移させることに成功している。

【特許文献1】

開2003-339396号公報

産業上の利用分野



本発明は、グリコサミノグリカン糖鎖などの糖鎖をコアタンパク質などのコア物質に効率的に付加する方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
少なくとも以下の3つの工程を含んでなることを特徴とするコア物質への糖鎖付加方法。
工程A: キシロシルセリン結合(Xyl-Ser)を有する糖タンパク質および/またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド-β-キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程。
工程B: コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程。
工程C: 工程Aで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Bで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程。

【請求項2】
糖タンパク質がプロテオグリカンであり、糖鎖がグリコサミノグリカン糖鎖であることを特徴とする請求項1記載の糖鎖付加方法。

【請求項3】
糖ペプチドがプロテオグリカンのタンパク質分解酵素による分解生成物であるペプチドグリカンであることを特徴とする請求項1記載の糖鎖付加方法。

【請求項4】
アルキニル基含有アルコールがプロパルギルアルコールであることを特徴とする請求項1記載の糖鎖付加方法。

【請求項5】
工程Aで得るアルキニル基含有糖鎖が一般式:X-4Xylβ1-O-(CH-C≡CH(Xは1個以上の糖残基を表し、mは1~6の整数を表す)で表されることを特徴とする請求項1記載の糖鎖付加方法。

【請求項6】
工程Bで得るアジド基含有物質が下記の一般式(1)で表されることを特徴とする請求項1記載の糖鎖付加方法。
【化1】


[式中、YはO,S,NHのいずれかを表し、Zはコア物質を表し、nは1以上の整数を表す]

【請求項7】
工程Cで得る糖鎖付加物質が下記の一般式(2)で表されることを特徴とする請求項1記載の糖鎖付加方法。
【化2】


[式中、X,Y,Z,m,nはそれぞれ前記と同義である]

【請求項8】
一般式:X-4Xylβ1-O-(CH-C≡CH(Xとmは前記と同義である)で表されることを特徴とするアルキニル基含有糖鎖

【請求項9】
下記の一般式(2)で表されることを特徴とする糖鎖付加物質。
【化4】


[式中、X,Y,Z,m,nはそれぞれ前記と同義である]
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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