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配糖化酵素、及びそれを利用した糖で二置換されたC配糖体の製造方法 コモンズ

国内特許コード P140010956
整理番号 N13088
掲載日 2014年8月28日
出願番号 特願2014-085317
公開番号 特開2015-204752
出願日 平成26年4月17日(2014.4.17)
公開日 平成27年11月19日(2015.11.19)
発明者
  • 田口 悟朗
  • 伊藤 崇充
出願人
  • 国立大学法人信州大学
発明の名称 配糖化酵素、及びそれを利用した糖で二置換されたC配糖体の製造方法 コモンズ
発明の概要 【課題】 基質に糖を炭素-炭素結合させその糖で二置換のC配糖体を人工的に簡易に生成させる酵素活性を有する新規な配糖化酵素、それを利用し配糖化して糖で二置換のC配糖体を製造する方法を提供する。
【解決手段】 配糖化酵素は、柑橘類又は豆類に由来するものであって、フェニルプロパノイド及びフェニルアセトフェノンから選ばれる基質の骨格中の2炭素原子にそれぞれ糖を炭素-炭素結合させその糖で二置換のC配糖体を生成させる酵素活性を、有している。配糖化方法は、配糖化酵素をコードするDNAを、有する配糖化酵素遺伝子を利用して、二置換のC配糖体を生成させるものである。
【選択図】図2
従来技術、競合技術の概要


配糖体は、糖以外の基質(アグリコン)と、単糖又はオリゴ糖とが結合した成分群であり、主に植物や微生物中に二次代謝産物として産生、蓄積される。この際、植物や微生物中では、配糖化酵素による糖転移反応(配糖化)が行われている。これら配糖化酵素を用いた配糖体の製造方法について、報告がなされている(特許文献1、2)。



多くの配糖体は、糖が基質のヒドロキシ基に結合したO配糖体であるが、カルボキシ基に結合したカルボキシ配糖体、アミノ基に結合したN配糖体、チオール基に結合したS配糖体、ニトリルの隣の水酸基に結合した青酸配糖体など、様々なものが報告されている(非特許文献1)。



上記に挙げた配糖体は、いずれも基質と糖との結合にヘテロ原子を介して配糖化したものである。一方、その他の配糖体として、基質の炭素原子に糖の炭素原子が直接共有結合したC配糖体と呼ばれる配糖体も、広く存在する。



C配糖体は、その特徴的な炭素-炭素結合様式により、グルコシダーゼや酸による加水分解を受けないため、O配糖体などと比較して、非常に安定である。



C配糖体は、微生物や植物、昆虫などの生物で形成される二次代謝産物で自然界に分布している。それらは、鉄輸送担体や抗生物質、抗酸化物質、誘因物質、摂食抑制物質など、生体内で多様な機能を示すことが知られている(非特許文献2、3)。



C配糖体を生合成する配糖化酵素については、2009年にイネにおけるC配糖化酵素OsCGTを部分精製し、その遺伝子が同定されており(非特許文献4)、それを使用した配糖化方法について、報告がされている(非特許文献5、6)。また、最近トウモロコシにおける新規なC配糖化酵素について、報告がされている(非特許文献7)。

産業上の利用分野


本発明は、基質に糖を炭素-炭素結合させて糖で二置換されたC配糖体を生成させる新規な配糖化酵素に関する。更にその配糖化酵素を発現させる配糖化酵素遺伝子、配糖化酵素をコードするcDNA、配糖化酵素遺伝子を組み込んでいるプラスミド並びにそれを導入した形質転換体、及び形質転換体を用いた新規な配糖化方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
柑橘類又は豆類に由来する配糖化酵素であって、
フェニルプロパノイド類及びアセトフェノン類から選ばれる基質の骨格中の2炭素原子にそれぞれ糖を炭素-炭素結合させその糖で二置換されたC配糖体を生成させる酵素活性を、有することを特徴とする配糖化酵素。

【請求項2】
前記基質が、水酸基でフェニル基の水素を置換していてもよいもので、フラボノイド及びジヒドロカルコンから選ばれる前記フェニルプロパノイド類であり、又はアセトフェノン及びα-フェニルアセトフェノンから選ばれる前記アセトフェノン類であることを特徴とする請求項1に記載の配糖化酵素。

【請求項3】
配列表の配列番号1~4のいずれかで示されるアミノ酸配列と、配列表の配列番号1~4のいずれかで示されるアミノ酸配列のうち前記酵素活性を保持する範囲で1個又は2個以上のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加した改変アミノ酸配列とのいずれかを有することを特徴とする請求項1~2のいずれか1項に記載の配糖化酵素。

【請求項4】
請求項1~3のいずれか1項に記載の配糖化酵素をコードするDNAを、有することを特徴とする配糖化酵素遺伝子。

【請求項5】
前記DNAが、配列表の配列番号5~8のいずれかで示される塩基配列と、配列表の配列番号5~8のいずれかで示される塩基配列のうちコードする前記配糖化酵素の前記酵素活性が保持される範囲で1個又は2個以上の塩基が欠失、置換及び/又は付加した改変塩基配列とのいずれかを有することを特徴とする請求項4に記載の配糖化酵素遺伝子。

【請求項6】
請求項1~3のいずれか1項に記載された配糖化酵素をコードするcDNA。

【請求項7】
請求項5~6のいずれか1項に記載の配糖化酵素遺伝子を組み込んでいることを特徴とするプラスミド。

【請求項8】
請求項7に記載のプラスミドが宿主細胞に導入されて成ることを特徴とする形質転換体。

【請求項9】
前記宿主細胞が、大腸菌であることを特徴とする請求項8に記載の形質転換体。

【請求項10】
請求項8~9のいずれか1項に記載の形質転換体と、フェニルプロパノイド類及びアセトフェノン類から選ばれる基質と、糖とを、共にインキュベーションする工程を含むことにより、前記基質の骨格中の2炭素原子にそれぞれ前記糖を炭素-炭素結合させて、その糖で二置換のC配糖体を生成させて、前記基質を配糖化することを特徴とする糖で二置換されたC配糖体の製造方法。

【請求項11】
前記基質が、それのフェニル基の水素を水酸基で置換していてもよいもので、フラボノイド及びジヒドロカルコンから選ばれる前記フェニルプロパノイド類であり、又はアセトフェノン及びα-フェニルアセトフェノンから選ばれる前記アセトフェノン類であることを特徴とする請求項10に記載の配糖化方法。

【請求項12】
請求項9~10のいずれか1項に記載の配糖化方法により製造されたもので、フェニルプロパノイド類及びアセトフェノン類から選ばれる基質の骨格中の2炭素原子にそれぞれ糖が炭素-炭素結合しており、その糖で二置換された配糖体であることを特徴とする糖で二置換のC配糖体。

【請求項13】
請求項12に記載の糖で二置換のC配糖体を有効成分として含有しており、飲食品、医薬品、サプリメント、及び飼料から選ばれるのいずれかであることを特徴とするC配糖体含有製品。

国際特許分類(IPC)
Fターム
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出願権利状態 公開
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