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近赤外光によりRNAを細胞質内に送達するための新規なキャリア分子ならびに方法 コモンズ

国内特許コード P150011238
掲載日 2015年1月30日
出願番号 特願2013-505776
登録番号 特許第5900895号
出願日 平成23年11月24日(2011.11.24)
登録日 平成28年3月18日(2016.3.18)
国際出願番号 JP2011077075
国際公開番号 WO2012127739
国際出願日 平成23年11月24日(2011.11.24)
国際公開日 平成24年9月27日(2012.9.27)
優先権データ
  • 特願2011-063953 (2011.3.23) JP
発明者
  • 大槻 高史
  • 石躍 由佳
出願人
  • 国立大学法人 岡山大学
発明の名称 近赤外光によりRNAを細胞質内に送達するための新規なキャリア分子ならびに方法 コモンズ
発明の概要 本発明では、細胞障害や発熱の問題を起こさず、生体透過性のよい(好ましくは波長700~1000nm程度の)近赤外光を利用してRNAを細胞内に導入する手段を提供することを目的とする。本発明に係るキャリア分子は、細胞膜透過性ペプチド(CPP)およびRNA結合性蛋白質(RBP)を含むキャリア蛋白質と、該キャリア蛋白質のN末端側またはC末端側に連結した、近赤外線領域の波長を有する光で機能する光増感剤(PST)とからなる構造を有することを特徴とする。該キャリア分子と該キャリア分子中のRBPに結合したRNAとからなるキャリア分子/RNA複合体を形成させ、該複合体を細胞と接触させて該細胞内のエンドソームに局在化させた後、該キャリア分子/RNA複合体中のPSTが機能する近赤外光を照射することにより、該キャリア分子/RNA複合体を細胞質中に拡散させて、導入したRNAの機能を発現させることができる。
従来技術、競合技術の概要



RNAiは、shRNAやsiRNAの塩基配列に依存して特定遺伝子の発現が抑制される現象であり、病気の原因となる遺伝子やウイルス遺伝子の発現抑制に基づく疾患治療などに応用できるため近年非常に注目されている。このような目的のために、RNAを細胞質内に効率的に導入する手段の研究開発が進められている。





特許文献1には、RNA結合性タンパク質および膜透過性キャリアペプチドを含む融合タンパク質に、該RNA結合性タンパク質に対する認識配列および任意の配列を有するRNAを結合させ、この結合体を任意の細胞と混合することにより、該RNAを細胞内に導入する方法が記載されている。





非特許文献1および2には、RNA結合性タンパク質および膜透過性キャリアペプチドに加えて可視領域の波長の光で励起する蛍光色素(たとえばAlexa Fluor 546、励起波長530-550nm)を含む融合タンパク質にsiRNAを結合させた複合体が記載されている。そして、この結合体と細胞を接触させ、当該結合体がエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれエンドソームに局在化した後、励起光を照射することにより、蛍光色素が光増感剤として作用し、siRNAがエンドソームから細胞質に放出され、所定のRNAi効果を達成できることが記載されている(図1参照)。なお、非特許文献1および2には、近赤外領域の波長の光で励起する蛍光色素を用いても上記のような作用効果が奏されることは、記載も示唆もされていない。





一方、特許文献2には、機能性分子キャリアとして金ナノロッドを用い、金ナノロッド凝集体とDNAとの複合体を培養細胞に添加し、近赤外域(波長1064nm)のパルスレーザーを照射することにより、DNAを金ナノロッドから脱離させて、当該DNAからの遺伝子を効率的に発現させる方法が記載されている(実施例参照)。しかしながら、金ナノロッドは光熱変換機能を有し、金ナノロッドを集積させた標的部位周辺組織へのフォトサーマル治療(腫瘍細胞等を発生した熱で死滅させる)ために用いられている材料でもあるため(たとえば特許文献3参照)、そのようなことを目的としない使用における細胞毒性や安全性について懸念される。

産業上の利用分野



本発明は、所定の機能を発現しうるRNA(機能性RNA)を細胞内に導入し、所定の波長を有する光を照射することによりその機能を発現させるための方法および当該方法に用いられるキャリア分子などに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
細胞膜透過性ペプチド(CPP)およびRNA結合性蛋白質(RBP)を含むキャリア蛋白質と、該キャリア蛋白質のN末端側またはC末端側に連結した、700nm~1000nmの波長を有する光で機能する光増感剤(PST)とからなる構造を有するキャリア分子であって、
前記光増感剤(PST)は、下記構造式で表される化合物(DY750:商標)、図3に示す蛍光スペクトルを有する化合物(Alexa Fluor750:登録商標)または図4に示す吸収スペクトルを有する化合物(IRDye800CW:登録商標)であることを特徴とするキャリア分子。
【化1】




【請求項2】
前記キャリア蛋白質が、さらにプロテアソーム分解シグナル配列タグ(PDS)および/またはHis-richタグ(HR)を含む、請求項1に記載のキャリア分子。

【請求項3】
前記キャリア蛋白質において、N末端側から、細胞膜透過性ペプチド(CPP)、RNA結合性蛋白質(RBP)、プロテアソーム分解シグナル配列タグ(PDS)および/またはHis-richタグ(HR)がこの順序で連結されており、かつ当該キャリア蛋白質のC末端側に前記光増感剤(PST)が連結されている、請求項1またはに記載のキャリア分子。

【請求項4】
前記CPPが、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト免疫不全ウイルス由来Tat(trans-activator of transcription)蛋白質中の12アミノ酸からなるペプチドである、請求項1~3のいずれかに記載のキャリア分子。
YGRKKRRQRRRG 配列番号1

【請求項5】
前記RBPが、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト由来U1A(U1 small nuclear ribonucleoprotein A)のRNA結合ドメインである、請求項1~4のいずれかに記載のキャリア分子。
AVPETRPNHTIYINNLNEKIKKDELKKSLYAIFSQFGQILDILVSRSLKMRGQAFVIFKEVSSATNALRSMQGFPFYDKPMRIQYAKTDSDIIAKMK 配列番号4

【請求項6】
請求項1~5のいずれかに記載のキャリア分子と、該RNAキャリア分子中のRBPに結合したRNAとからなる構造を有するキャリア分子/RNA複合体。

【請求項7】
前記RNAが、short hairpin RNA(shRNA)、small interfering RNA(siRNA)またはmicroRNA(miRNA)である、請求項に記載のキャリア分子/RNA複合体。

【請求項8】
請求項またはに記載のキャリア分子/RNA複合体を含む遺伝子治療薬。

【請求項9】
がんまたはウイルス疾患を対象とする、請求項に記載の遺伝子治療薬。

【請求項10】
生体外において、請求項またはに記載のキャリア分子/RNA複合体を細胞と接触させて当該細胞内のエンドソームに局在化させる工程、および該キャリア分子/RNA複合体中のPSTが機能する近赤外線領域の波長を有する光を照射して該キャリア分子/RNA複合体を細胞質中に拡散させる工程を含むことを特徴とする、細胞質内へのRNAの送達方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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