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外来遺伝子導入用ベクター及び外来遺伝子が導入されたベクターの製造方法

国内特許コード P150011242
掲載日 2015年1月30日
出願番号 特願2012-533169
登録番号 特許第5246904号
出願日 平成24年3月27日(2012.3.27)
登録日 平成25年4月19日(2013.4.19)
国際出願番号 JP2012057875
国際公開番号 WO2012133376
国際出願日 平成24年3月27日(2012.3.27)
国際公開日 平成24年10月4日(2012.10.4)
優先権データ
  • 特願2011-075273 (2011.3.30) JP
発明者
  • 堀井 雅恵
  • 岸 裕幸
  • 小林 栄治
  • 小澤 龍彦
  • 村口 篤
出願人
  • 国立大学法人富山大学
発明の名称 外来遺伝子導入用ベクター及び外来遺伝子が導入されたベクターの製造方法
発明の概要 本発明の課題は、互いに相同な複数の配列を有するベクターに外来遺伝子を相同組換えにより導入する方法において、外来遺伝子が導入されたベクターを効率的に選択することができる手段を提供することにある。
複製起点、配列A、マーカー遺伝子X、相同組換えにより外来遺伝子を導入するための二つの配列C及びD、並びに前記配列Aと相同な配列Bをこの順に含むベクターであって、前記二つの配列C及びDは、直接または間接的に隣接し、前記隣接する二つの配列C及びDの間に外来遺伝子を導入するために用いられるためのベクター。
従来技術、競合技術の概要



従来、ベクターに目的遺伝子を導入するためには、通常、制限酵素が用いられている。具体的には、ベクターをマルチクローニング・サイトにおいて特定の制限酵素で切断し、その切断された部位に、その制限酵素部位に一致する制限酵素部位を有する目的遺伝子の核酸断片を導入していた。近年、ベクターに存在する二つ配列のそれぞれと相同な二つの配列を両端に有する目的遺伝子を含む核酸断片を準備し、ベクターにおける前記二つの配列と核酸断片における前記二つの配列との間で相同組換えを起こさせることにより、目的遺伝子をベクターに導入する方法が開発され、使用され始めている(Zhang Y, Muyrers J.P.P., Testa G and Stewart A.F. DNA cloning by homologous recombination in E.Coli. Nature Biotechnology 18:1314-1317, 2000、及びQuinn Lu, Seamless cloning and gene fusion. TRENDS in Biotechnology 23: 199-207, 2005)。

産業上の利用分野



本発明は、相同組換えにより外来遺伝子を導入するために用いられるためのベクター及び外来遺伝子が導入されたベクターの製造方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
複製起点、配列A、マーカー遺伝子X、相同組換えにより外来遺伝子を導入するための二つの配列C及びD、並びに前記配列Aと相同な配列Bをこの順に含むベクターであって、
前記二つの配列C及びDは、直接または間接的に隣接し、配列Cと相同な配列C’、外来遺伝子、及び配列Dと相同な配列D’をこの順に含む核酸断片とともに相同組換えを起こす条件下に置くことにより、前記隣接する二つの配列C及びDの間に外来遺伝子を導入するために用いられ
配列Aと配列Bとは、該条件下で相同組換えを生じさせうるものであり、複製起点は、組換えベクター製造用の宿主において機能可能であり、マーカー遺伝子Xは、組換えベクター製造用の宿主において発現可能なようにベクターに含まれており、それにより組換えベクター製造用の宿主におけるマーカー遺伝子Xの発現を指標として、前記隣接する二つの配列C及びDの間に外来遺伝子が導入されたベクターを有する宿主の選抜を可能にする、ベクター。

【請求項2】
ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項1に記載のベクター。

【請求項3】
ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項1又は2に記載のベクター。

【請求項4】
前記配列Aがレトロウイルスのゲノムに含まれる3’LTRであり、かつ前記配列Bがレトロウイルスのゲノムに含まれる5’LTRである、請求項1~3のいずれか1項に記載のベクター。

【請求項5】
前記配列Aがレトロウイルスのゲノムに含まれる5’LTRであり、かつ前記配列Bがレトロウイルスのゲノムに含まれる3’LTRである、請求項1~3のいずれか1項に記載のベクター。

【請求項6】
マーカー遺伝子Xが、蛍光タンパク質遺伝子又は薬剤耐性遺伝子である、請求項1~5のいずれか1項に記載のベクター。

【請求項7】
マーカー遺伝子Xが、ルシフェラーゼ又はβ‐ガラクトシダーゼをコードする遺伝子である、請求項1~5のいずれか1項に記載のベクター。

【請求項8】
複製起点及び配列Aは間接的に隣接し、かつ前記隣接する複製起点及び配列Aの間に、マーカー遺伝子Xとは異なるマーカー遺伝子Yをさらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のベクター。

【請求項9】
複製起点及び配列Bは間接的に隣接し、かつ前記隣接する複製起点及び配列Bの間に、マーカー遺伝子Xとは異なるマーカー遺伝子Yをさらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のベクター。

【請求項10】
マーカー遺伝子Yが、蛍光タンパク質遺伝子又は薬剤耐性遺伝子である、請求項8又は9に記載のベクター。

【請求項11】
マーカー遺伝子Yが、ルシフェラーゼ又はβ‐ガラクトシダーゼをコードする遺伝子である、請求項8又は9に記載のベクター。

【請求項12】
複製起点が、大腸菌(Escherichia coli)、バクテリオファージ、Saccharomyces cerevisiae、及びSchizosaccharomyces pombeから選択される生物の複製起点である、請求項1~11のいずれか1項に記載のベクター。

【請求項13】
請求項1~12のいずれか1項に記載のベクターにおいて前記隣接する配列C及びDの間に外来遺伝子が導入されたベクターを製造する方法であって、以下の工程を含む方法:
請求項1~12のいずれか1項に記載のベクターを準備する工程(1)、
前記配列Cと相同な配列C’、外来遺伝子、及び前記配列Dと相同な配列D’をこの順に含む核酸断片を準備する工程(2)、
前記ベクターと前記核酸断片とを相同組換えを起こす条件下に置くことによる前記隣接する配列C及びDの間に外来遺伝子が導入されたベクターの生成、及び前記隣接する配列C及びDの間に外来遺伝子が導入されたベクターを有する宿主の形成を行う工程(3)、
工程(3)で得られた宿主を培養し、培養物中からマーカー遺伝子Xの発現を指標として、配列C及びDの間に外来遺伝子が導入されたベクターを有する宿主を選抜する工程(4)、及び
工程(4)において選抜した宿主から配列C及びDの間に外来遺伝子が導入されたベクターを抽出する工程(5)。

【請求項14】
前記工程(3)は、相同組換えを起こす酵素と、前記ベクター及び前記核酸断片とを混合して相同組換え産物を得、得られた産物を宿主に形質転換することにより実施される、請求項13に記載の方法。

【請求項15】
前記工程(3)は、相同組換えを起こす酵素をコードする遺伝子及び前記ベクターと前記核酸断片とを含む宿主を得、得られた宿主において前記相同組換えを起こす酵素をコードする遺伝子を発現させることにより実施される、請求項13に記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録
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