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核酸増幅方法およびその利用 新技術説明会

国内特許コード P150011252
掲載日 2015年1月30日
出願番号 特願2013-504733
登録番号 特許第5688702号
出願日 平成24年3月13日(2012.3.13)
登録日 平成27年2月6日(2015.2.6)
国際出願番号 JP2012056381
国際公開番号 WO2012124681
国際出願日 平成24年3月13日(2012.3.13)
国際公開日 平成24年9月20日(2012.9.20)
優先権データ
  • 特願2011-055327 (2011.3.14) JP
発明者
  • 中島 千絵
  • 鈴木 定彦
  • 福島 由華里
出願人
  • 国立大学法人北海道大学
発明の名称 核酸増幅方法およびその利用 新技術説明会
発明の概要 以下の(a)~(e)を含む反応液を調製する反応液調製工程と、得られた反応液を用いて核酸合成を行う核酸合成工程とを有し、核酸合成工程の後に核酸の熱変性工程を有しないことを特徴とする核酸増幅方法は、特殊な機器を必要とせず、迅速、簡便、低コストで実施可能であり、高い増幅効率と高い特異性を兼ね備えた核酸増幅方法である。
(a)反復配列を有する鋳型核酸
(b)前記鋳型核酸の反復配列内に結合するプライマー1
(c)前記鋳型核酸の相補鎖の反復配列内に結合するプライマー2
(d)鎖置換型DNA合成酵素
(e)前記鎖置換型DNA合成酵素の基質となるヌクレオチド
従来技術、競合技術の概要



感染症の診断には、迅速・正確な病原の検出が必須である。感染症の原因病原体検出の有力な手段として、目的の病原体に特異的な遺伝子配列を検出する方法がある。しかしながら、試料中に存在する目的遺伝子の量が少ない場合における検出は容易でなく、目的遺伝子そのもの、または検出シグナルを増幅することが必要である。目的遺伝子を増幅するための核酸増幅方法として、PCR(Polymerase Chain Reaction)法が知られている。PCR法は、in vitroにおける核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法であり、その指数的な増幅効果に基づく高感度検出方法として定着している。しかしPCR法は、実施のために特別な温度調節装置が必要であるため、ベッドサイドでの病原体の迅速判定に適した方法ではない。





核酸を等温条件下で増幅し、目視による増幅の検出が可能な方法としてLAMP(Loop-mediated isothermal Amplification)法が実用化されている(特許文献1参照)。LAMP法は、プライマーの構造を工夫することによって増幅の促進を図るものであり、等温増幅を可能とするために、6領域または8領域を認識する4種または6種のプライマーが必要となる。そのため、プライマーDNAのデザイン法が複雑であり、必ずしも効率良い遺伝子増幅が起こるプライマーがデザインできるとは限らない。また、LAMP法では微量のターゲットを短時間に増幅するためPCRに比べて多量のプライマーを使用するが、多様な配列を持った4種または6種のプライマーを高用量で使用すると、非特異結合による偽陽性増幅の危険性が高くなる。さらに、プライマー合成に要する費用も無視できない。





感染症のなかで、結核は、現在でも世界中で年間900万人が新規患者として登録され、180万人が死亡している重要な感染症の一つである。早期に診断して適切な治療を開始することが感染の蔓延を防ぐ上で最善の策であるが、結核菌は培地上にコロニーを形成するまでに4週間以上を要することから、その診断に要する時間の短縮が大きな課題となっており、迅速な判定法の開発が求められている。そこで、結核等の感染症を迅速に判定するために、LAMP法に匹敵する反応速度および増幅効率を有し、LAMP法よりも特異性、簡便性、コストの点で優れた等温条件下で実施可能な核酸増幅方法の開発が望まれている。

産業上の利用分野



本発明は、核酸増幅方法およびその利用に関するものであり、詳細には、等温条件下で実施可能な核酸増幅方法およびその利用に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の(a)~(e)を含む反応液を調製する反応液調製工程と、得られた反応液を用いて核酸合成を行う核酸合成工程とを有し、核酸合成工程の後に核酸の熱変性工程を有しないことを特徴とする核酸増幅方法。
(a)反復配列を有する鋳型核酸
(b)前記鋳型核酸の反復配列内に特異的に結合するプライマー1
(c)前記鋳型核酸の相補鎖の反復配列内に特異的に結合するプライマー2
(d)鎖置換型DNA合成酵素
(e)前記鎖置換型DNA合成酵素の基質となるヌクレオチド

【請求項2】
プライマー1とプライマー2とが向き合った間隔に応じたサイズの増幅産物が生成することを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅方法。

【請求項3】
反復配列が、10~500塩基対の長さを有し、1000塩基対以内の間隔で3回以上存在することを特徴とする請求項1またはに記載の核酸増幅方法。

【請求項4】
核酸合成工程を等温で行うことを特徴とする請求項1~3のいずれかに記載の核酸増幅方法。

【請求項5】
請求項1~のいずれかに記載の核酸増幅方法を用い、目的の病原体が有する反復配列に特異的なプライマー1およびプライマー2による特異的増幅産物の有無を判定することを特徴とする病原体検出方法。

【請求項6】
請求項1~のいずれかに記載の核酸増幅方法を用い、目的のアレルゲンを提供する生物が有する反復配列に特異的なプライマー1およびプライマー2による特異的増幅産物の有無を判定することを特徴とするアレルゲン検出方法。

【請求項7】
請求項1~のいずれかに記載の核酸増幅方法を用い、目的の生物が有する反復配列に特異的なプライマー1およびプライマー2による特異的増幅産物の有無を判定することを特徴とする生物種鑑別方法。

【請求項8】
請求項1~のいずれかに記載の核酸増幅方法において、配列番号1で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号2で表される塩基配列からなるプライマー2とを用いることを特徴とする結核菌検出方法。

【請求項9】
請求項1~のいずれかに記載の核酸増幅方法において、配列番号3で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号4で表される塩基配列からなるプライマー2とを用いることを特徴とするサルモネラ菌検出方法。

【請求項10】
請求項1~のいずれかに記載の核酸増幅方法において、配列番号5で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号6で表される塩基配列からなるプライマー2とを用いることを特徴とするリーシュマニア検出方法。

【請求項11】
請求項1~のいずれかに記載の核酸増幅方法を実施するためのキットであって、
鋳型核酸の反復配列内に特異的に結合するプライマー1、および、当該鋳型核酸の相補鎖の反復配列内に特異的に結合するプライマー2、を包含することを特徴とするキット。

【請求項12】
さらに、鎖置換型DNA合成酵素を包含することを特徴とする請求項11に記載のキット。

【請求項13】
配列番号1で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号2で表される塩基配列からなるプライマー2とを包含し、結核菌の反復配列を特異的に増幅することを特徴とする請求項11または12に記載のキット。

【請求項14】
配列番号3で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号4で表される塩基配列からなるプライマー2とを包含し、サルモネラ菌の反復配列を特異的に増幅することを特徴とする請求項11または12に記載のキット。

【請求項15】
配列番号5で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号6で表される塩基配列からなるプライマー2とを包含し、リーシュマニアの反復配列を特異的に増幅することを特徴とする請求項11または12に記載のキット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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