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接触物体が発生する力を可視化および/または定量化するための表面改質方法およびこれを用いたスクリーニング方法、ならびにこれら方法に用いるキット コモンズ 新技術説明会

国内特許コード P150011253
掲載日 2015年2月2日
出願番号 特願2014-245641
公開番号 特開2016-042071
出願日 平成26年12月4日(2014.12.4)
公開日 平成28年3月31日(2016.3.31)
優先権データ
  • 特願2013-271755 (2013.12.27) JP
  • 特願2014-169119 (2014.8.22) JP
発明者
  • 出口 真次
  • 横山 奨
  • 松井 翼
出願人
  • 国立大学法人 名古屋工業大学
発明の名称 接触物体が発生する力を可視化および/または定量化するための表面改質方法およびこれを用いたスクリーニング方法、ならびにこれら方法に用いるキット コモンズ 新技術説明会
発明の概要 【課題】細胞等が発生する力を可視化および/または定量化するための、細胞等を被着あるいは接触させる高分子材料の表面改質方法。
【解決手段】高分子材料において、当該材料の表面を改質して弾性率を増大させ、当該改質した高分子材料の表面に物体を被着あるいは接触させ、当該高分子材料の表層に生じるシワを観察することにより、被着あるいは接触させる物体が発生する力を可視化および/または定量化するための表面改質方法であり、高分子材料の表面にマスクを付与して改質する部位を限定し、当該材料表面の変形を大きくする、あるいは前記高分子材料を予め加熱し、その間に、当該材料表面を改質して弾性率を増大させ、材料表面の限界座屈ひずみを下げてシワを発生しやすくする。
【選択図】図1
従来技術、競合技術の概要


骨格筋や心筋、平滑筋細胞などの筋肉細胞は力を発生し、隣接する他の細胞や、コラーゲンなどの生体繊維を変形させる。これらの筋肉細胞に限らず、およそ全ての細胞は力を発生する能力を備えており、運動することができる。例えば、腫瘍細胞は生体内を転移、すなわち自ら推進力を発生しながら運動して癌を促進する。また、一つの受精卵から多細胞の個体が形成される発生過程において、個々の細胞が発生する力の相互作用が正常な臓器形成のために重要な役割を果たしていることが明らかにされている。また、細胞が正常な力を発生するための機構に異常が生じた場合には、動脈硬化症など多くの深刻な疾患を引き起こすことが近年の研究から示唆されている。このように細胞が発生する力は細胞を評価するうえで重要な指標であり、生物学や医学分野においてその役割や発生機構について多くの研究が活発に行われている。例えば、癌などの病気の進行に伴い、細胞の発生力や、発生力と密接な関連のある力学的な硬さが個々の細胞において変化することが分かっている(非特許文献1参照)。つまり細胞の発生力を計測することは病気の進行度を測るための目安となりうるために、患者から取り出した個々の細胞の発生力を計測することは診断に利用できる可能性を有している。



細胞が発生する微小力を定量評価する方法としてこれまでに様々な方法が提示されている。しかしコストパフォーマンスや実用性などの理由により、実質的に使用されているのは以下の3方式に限られ、そのうち最も普及している技術は、米国のDemboとWangらの方法である(非特許文献2参照)。この方法は、ポリアクリルアミド(PAA)ゲルという柔らかい物質の表面に細胞が付着できるようにSulfo-SANPAHなどを用いた化学処理を施し、一方多数の蛍光ビーズ(直径が1μm未満の微小球)をできる限り均一な空間分布となるようにPAAゲル内に埋め込む。そこで、PAAゲル表面に細胞を播種するとその表面に接着され、PAAゲルを変形させる。PAAゲルの変形に伴い、その中に埋め込まれた蛍光ビーズも動くために、この蛍光ビーズをマーカーとしてPAAゲルのひずみを計測する。別途、PAAゲルの弾性率を測定することにより、応力を高精度に計測できる。本方法は、しかし、蛍光ビーズは直径が小さいほど大変高価となり、また、同一平面内の蛍光ビーズの動きを正確に調べるためには、高価な共焦点レーザー顕微鏡が必要である。



ところで、細胞生物学の研究では、細胞を観察する際に細胞内のタンパク質に蛍光タグを付けて蛍光観察を行う場合が多く、蛍光ビーズそのものの光の波長以外の蛍光波長を有するタグを用いる必要が生じ、実験を制限する。また、細胞自身がPAAゲル表面にある蛍光ビーズを飲み込んでしまい、細胞自身へのダメージになり、また観察精度を妨げる。また、同方法ではPAAゲル以外に、水を主成分とするハイドロゲルを用いることがあるが、このような水性ゲルの中には培養液成分が浸透してしまい、実験中に細胞を囲む培養液の性質が変わったり、溶液交換時に既に水性ゲル内にしみ込んでいた古い溶質がそのまま残る恐れがある。このように本方法は長時間の測定や、液交換を頻繁に行う実験には不向きである。また、観察を終了したあとに細胞をゲルから何らかの方法によってはがしとり、ひずみマーカーとなる蛍光ビーズの初期位置を正確に測る必要があり、これも実験を行ううえで制約となる。この点については、それを克服するためにあらかじめ蛍光ビーズなどのマーカーを規則的にゲル上に並べたものを用いることもある。



二番目の方法は無数に並べたマイクロピラーを用いる方法である(非特許文献3参照)。これは微小で柔らかいマイクロピラーの上に細胞を培養し、細胞が力を発生するとピラーをたわませるので、ピラーのたわみを光学顕微鏡により測定して発生力を検出するものである。しかし、マイクロピラーを作製するには、微細加工が必要であり、材料費も含めてきわめて高価となる。また、通常マイクロピラーはPDMS(ポリジメチルシロキサン)から作られるが、同材料は疎水性であるために、実験に先立ち水溶液がマイクロピラーの根元にまで浸透させるためには、あらかじめ浸透させた別の溶液から実験で用いる培養液に完全に入れ替わるように繰り返し液交換をする必要がある。また、力を正確に測定するために、マイクロピラーの上側表面だけに細胞を接着させるための特殊なコーティングを行う必要があり、多くの工夫を要する。さらに、マイクロピラーの上側表面のみに細胞を接着するため、細胞接着タンパク質複合体が面積を広げる挙動を妨げる。このようにマイクロピラーの形状が細胞の性質に影響を及ぼしかねないために、細胞生物学の研究への適用は不向きである。



三番目の方法は、マイクロパターニング技術を用いて細胞の発生力を計測する方法である。前二者に比べて新しい技術であるために普及度は比較的低いが、今後利用が進むと考えられる。ここで、マイクロパターニングとは細胞の接着領域を限定し、その結果、細胞の形態を人為的に操作するものである。例えば、特許文献1のFIGURE 4Eにあるように、細胞をPAAゲル上に、「いかり型」の形状にマイクロパターン化する。このとき、細胞の接着領域が、このいかり型形状の下側に局在することがわかっている。細胞が収縮力を発生すると、このいかり形状の下側を中心に向けて縮めようとする歪を生じる。一方、事前に、変形量と、細胞がPAAゲルに及ぼす応力の校正関係を求めておく。この校正関係には直線関係があることから、いかりの下側の変形量を調べることによって、細胞が発生する応力を測定することができるということである。ここで、細胞の形態をマイクロパターニングによって統一していることにより、校正関係が同一の傾きを有することを期待しているが、たとえ細胞の形態をマイクロパターニングによって統一するとしても、元々の細胞は同一の遺伝子を持っていても一般に異なるサイズを有しており、発生する力は個々の細胞ごとに異なる。従って校正関係も厳密には個々の細胞ごとに異なるかもしれず、同一の校正関係を用いることは不正確な測定結果を生じることにつながる可能性がある。

産業上の利用分野


本発明は細胞あるいは管等の壁への液体の接触等において発生する応力の可視化等の計測等に利用できる。

特許請求の範囲 【請求項1】
高分子材料の表面に物体を被着あるいは接触させ、当該高分子材料の表層に生じるシワを観察することにより、被着あるいは接触させる物体が発生する力を可視化および/または定量化するための表面改質方法であって、当該高分子材料の表面を改質して弾性率を増大させて、前記シワを発生しやすくする表面改質方法。

【請求項2】
前記高分子材料がシリコーンである請求項1に記載の表面改質方法。

【請求項3】
前記被着あるいは接触させる物体が細胞である、請求項1または2に記載の表面改質方法。

【請求項4】
前記高分子材料を改質する方法が、プラズマ照射、コロナ放電照射、UV照射により行う請求項1~3のいずれかに記載の表面改質方法。

【請求項5】
前記高分子材料表面の炭化水素基の一部もしくは全てを、酸素を含む官能基に置換する、請求項1~4のいずれかに記載の表面改質方法。

【請求項6】
前記高分子材料の表面にマスクを付与して改質する部位を限定し、物体が被着あるいは接触したときの当該材料表面の変形を大きくしてシワ発生の感度を向上させる、請求項1~5のいずれかに記載の表面改質方法。

【請求項7】
前記マスクを付与して改質する部位の面積を、被着あるいは接触させる物体と同じ面積または10倍以下の面積とする請求項6に記載の表面改質方法。

【請求項8】
前記高分子材料を容器内で予め加熱して膨張させ、膨張を維持した状態で、当該高分子材料表面を改質してシワ発生の感度を向上させる、請求項1~5のいずれかに記載の計測方法。

【請求項9】
前記予め加熱する温度が35℃~75℃である、請求項8に記載の表面改質方法。

【請求項10】
前記高分子材料を改質する方法が、プラズマ照射、コロナ放電照射、UV照射により行う請求項8または請求項9に記載の表面改質方法。

【請求項11】
請求項1~10に記載の表面改質方法により、被着あるいは接触させる物体が発生する力を可視化および/または定量化するスクリーニング方法。

【請求項12】
請求項1~10に記載の表面改質した高分子材料を基台上の少なくとも1箇所に載せたキット。
国際特許分類(IPC)
画像

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出願権利状態 公開
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