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PINK1のユビキチン化アッセイ及びスクリーニングへの利用 新技術説明会

国内特許コード P150011312
整理番号 S2012-0927-N0
掲載日 2015年2月16日
出願番号 特願2012-165160
公開番号 特開2014-025764
登録番号 特許第6024953号
出願日 平成24年7月25日(2012.7.25)
公開日 平成26年2月6日(2014.2.6)
登録日 平成28年10月21日(2016.10.21)
発明者
  • 許 南浩
  • 村田 等
  • 阪口 政清
出願人
  • 国立大学法人 岡山大学
発明の名称 PINK1のユビキチン化アッセイ及びスクリーニングへの利用 新技術説明会
発明の概要 【課題】本発明は、PINK1のユビキチン化検出のためのアッセイ方法を提供し、さらに、該アッセイ方法を用いたPINK1のユビキチン化を亢進するタンパク質や化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【解決手段】PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6とをユビキチン活性化酵素(E1)及びユビキチン結合酵素(E2)並びにATPの存在下で接触させ、PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6との複合体形成を検出することを含む、PINK1のユビキチン化を検出する方法。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要



パーキンソン病は中脳のドーパミン分泌細胞の変性を主な原因とする神経変性疾患である。この神経細胞変性の1つの原因として、ミトコンドリアの機能不全(不要ミトコンドリアの蓄積)が挙げられる。細胞内で不要になったミトコンドリアの除去には、パーキンソン病原因遺伝子の1つでユビキチンE3リガーゼであるParkinが働く(非特許文献1を参照)。Parkinによる不要ミトコンドリア除去には、ミトコンドリア膜上へのPTEN-induced putative kinase 1(PINK1)の蓄積が必要である(非特許文献2及び3を参照)。しかし、PINK1の蓄積(安定化)のメカニズムはこれまで明らかとなっていなかった。





PINK1は主にミトコンドリアに局在するセリン・スレオニンキナーゼで、PINK1の変異はパーキンソン病発症に関わっていることが報告されている(非特許文献4を参照)。

産業上の利用分野



本発明は、パーキンソン病等の疾患に関与するPINK1のユビキチン化を検出する方法及び該方法を用いたPINK1が関与する疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6とをユビキチン活性化酵素(E1)及びユビキチン結合酵素(E2)並びにATPの存在下で接触させ、PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6との複合体形成を検出することを含む、PINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項2】
in vitroで行う、請求項1記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項3】
プルダウンアッセイを用いて行う、請求項1又は2に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項4】
ペプチドタグと融合したPINK1、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6とをユビキチン活性化酵素(E1)及びユビキチン結合酵素(E2)並びにATPの存在下で、in vitroで反応させ複合体を形成させ、PINK1と融合したエピトープと特異的に結合する化合物を結合させた担体を用いて複合体を回収したのち、抗ユビキチン抗体を用いて複合体中のユビキチンを検出することにより、PINK1がユビキチンと結合しユビキチン化したかどうかを検出する、請求項3記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項5】
SARM1αが第1~106番目のアミノ酸配列からなるドメインを含む、SARM1αの断片である、請求項1~4のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項6】
ユビキチン結合酵素(E2)がUbcH13/Uev1aである、請求項1~5のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項7】
in vivoで行う、請求項1記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項8】
培養細胞中でPINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)並びにユビキチン結合酵素(E2)を発現させることを含む、請求項7記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項9】
SARM1αが第1~106番目のアミノ酸配列からなるドメインを含む、SARM1αの断片である、請求項7又は8に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項10】
ユビキチン結合酵素(E2)がUbcH13/Uev1aである、請求項7~9のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。

【請求項11】
請求項1~10のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法を用いて、パーキンソン病の予防又は治療に用い得る薬剤をスクリーニングする方法であって、請求項1~10のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法において、候補薬剤を添加し、候補薬剤の添加によりPINK1のユビキチン化が促進されたかどうかを測定し、候補薬剤の添加によりPINK1のユビキチン化が促進された場合に、候補薬剤がパーキンソン病の予防又は治療に用い得ると評価する、スクリーニング方法。

【請求項12】
PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵素(E2)並びにATPを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法でPINK1のユビキチン化を検出するためのキット。

【請求項13】
PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)並びにユビキチン結合酵素(E2)をコードするDNAを含む、請求項7~10のいずれか1項に記載の方法でPINK1のユビキチン化を検出するためのキット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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