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目的細胞の分離方法およびその目的細胞の分離装置

国内特許コード P150011320
整理番号 S2013-0111-N0
掲載日 2015年2月18日
出願番号 特願2012-234653
公開番号 特開2014-083000
出願日 平成24年10月24日(2012.10.24)
公開日 平成26年5月12日(2014.5.12)
発明者
  • 藤井 輝夫
  • 金田 祥平
  • 荒木 文子
出願人
  • 一般財団法人生産技術研究奨励会
発明の名称 目的細胞の分離方法およびその目的細胞の分離装置
発明の概要 【課題】夾雑物を含む溶液から目的細胞をそのサイズとアフィニティを考慮して分離し、分離後の細胞の解析および培養を可能にする、目的細胞の分離方法およびその目的細胞の分離装置を提供する。
【解決手段】目的細胞5の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルター3と、このマイクロフィルターの一部を構成する基板1表面に、目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子2Aの修飾表面2を形成する、目的細胞の分離装置。および、前記細胞分離装置に、前記目的細胞および夾雑物となる非目的細胞5’が懸濁された溶液を導入し、前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞4,4’を反応させ、前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離する、目的細胞の分離方法。
【選択図】図2
従来技術、競合技術の概要



従来の夾雑物を含む溶液からの細胞分離法としては、目的細胞表面に特異的に発現しているたんぱく質と結合する抗体を用いるもの(イムノアフィニティ)が主流である。具体的には蛍光修飾抗体を用いて染色した細胞を含む懸濁液を微小流路内に導入し、レーザーを用いて細胞の蛍光強度を解析し、強度に応じて細胞を分離・分取するFACS(Fluorescent Activated Cell Sorting)や抗体修飾磁気粒子とその細胞懸濁液を混合し、磁気粒子に補足された目的細胞だけを磁力によって分離するMACS(Magnetic Activated Cell Sorting)と呼ばれる分離技術が開発され、その装置が市販されている。市販されている装置以外では、抗体修飾したマイクロポスト構造を内部に持つ微小流路を利用したアフィニティ分離(下記非特許文献1参照)や細胞のサイズを用いた分離も行われている(下記非特許文献2参照)。

産業上の利用分野



本発明は、目的細胞の分離方法およびその目的細胞の分離装置に関するものであり、特に、夾雑物を含む溶液から目的細胞を分離し、分離後の細胞を解析および培養する技術に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】
(a)目的細胞の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターと、該マイクロフィルターの一部を構成する基板表面に目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面とを形成し、
(b)そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞が懸濁された溶液を導入し、
(c)前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、
(d)前記マイクロフィルターの下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加させて、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより小さい非目的細胞を除去・回収することで、前記非目的細胞と前記目的細胞を分離し、
(e)さらにリンス液を導入し、
(f)前記リンス液を攪拌する操作を行い、前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい目的細胞を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞を分離することを可能とし、
(g)前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞のみを前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離することを特徴とする目的細胞の分離方法。

【請求項2】
請求項1記載の目的細胞の分離方法において、細胞剥離液を用いて前記修飾表面上から前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を離脱させ、その後に、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞をサイズ毎に回収することを特徴とする目的細胞の分離方法。

【請求項3】
(a)目的細胞の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターとしての微細構造を有する貫通穴フィルターを構成する基板表面に目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面とを形成し、
(b)そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞が懸濁された溶液を導入し、
(c)前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、
(d)続いて前記貫通穴フィルターの下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記貫通穴フィルターのサイズより小さい非目的細胞を除去・回収し、
(e)さらにリンス液を導入し、
(f)前記リンス液を攪拌する操作を行い、前記貫通穴フィルターのフィルタリングサイズより大きい目的細胞を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞を分離することを可能とし、
(g)前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞のみを前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離することを特徴とする目的細胞の分離方法。

【請求項4】
請求項3記載の目的細胞の分離方法において、細胞剥離液を用いて前記基板の修飾表面上から前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を離脱させ、その後に、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞をサイズ毎に回収することを特徴とする目的細胞の分離方法。

【請求項5】
請求項1又は3記載の目的細胞の分離方法において、前記生体高分子が抗体、核酸アプタマー又はペプチドアプタマーであることを特徴とする目的細胞の分離方法。

【請求項6】
目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面を形成した基板とマイクロフィルターとが一体的に形成され、特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい細胞と特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい細胞を含む溶液を導入し、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞および前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい細胞を前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい細胞と分離することを特徴とする目的細胞の分離装置。

【請求項7】
請求項6記載の目的細胞の分離装置において、前記生体高分子が固定化された基板が底面に配置され、該底面上に前記マイクロフィルターが形成されることを特徴とする目的細胞の分離装置。

【請求項8】
請求項6記載の目的細胞の分離装置において、前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズが3~50μmであることを特徴とする目的細胞の分離装置。

【請求項9】
請求項6記載の目的細胞の分離装置において、前記生体高分子が抗体、核酸アプタマー又はペプチドアプタマーであることを特徴とする目的細胞の分離装置。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2012234653thum.jpg
出願権利状態 公開


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