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低酸素耐性ヒラメの識別方法

国内特許コード P150011353
整理番号 S2012-1126-N0
掲載日 2015年2月18日
出願番号 特願2012-200031
公開番号 特開2014-054203
登録番号 特許第6041259号
出願日 平成24年9月12日(2012.9.12)
公開日 平成26年3月27日(2014.3.27)
登録日 平成28年11月18日(2016.11.18)
発明者
  • 岡本 信明
  • 坂本 崇
  • 長谷川 理
出願人
  • 国立大学法人東京海洋大学
  • 神奈川県
発明の名称 低酸素耐性ヒラメの識別方法
発明の概要 【課題】ヒラメの低酸素に対する抵抗性の相違と遺伝要因との関係を客観的に明らかにするとともに、これら系統魚を用いて、低酸素の耐性に関する量的形質解析(QTL法)により低酸素耐性の出現原因と関連するDNAマーカーとそのマーカーを用いて低酸素耐性のヒラメを識別する方法の提供。
【解決手段】ヒラメ、その卵又はそれらの加工品から抽出したDNAについて、特定な配列からなる塩基配列のマイクロサテライト領域の配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅する工程から成るヒラメが低酸素耐性であるか否かを識別する方法。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要



従来からヒラメの飼育は、仔魚から成魚まで、海水をポンプで陸上の飼育施設に揚水して、行われている。

このため、夏季の高水温期には、飼育水中の溶存酸素の減少により酸欠やこれらに起因した疾病被害がしばしば発生し、産業的に深刻な被害が生じている。

このため、ヒラメの飼育施設では、飼育密度を低く抑えたり、酸欠を防止するために液体酸素施設や酸素発生器などを設置し、飼育水の溶存酸素濃度の確保を図っている。しかし、これらの対策は、施設の維持や液化酸素などに多額の費用を要し、生産コストを上げる一因となっている。

ニジマスについては、低酸素耐性形質が遺伝することが確かめられている(非特許文献1)。

またヒラメの遺伝子連鎖地図は公開されている(非特許文献2)。

産業上の利用分野



この発明は、ヒラメが低酸素耐性であるか否かを識別する方法及びそのためのDNAマーカーに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
下記工程から成る低酸素耐性ヒラメの識別方法。
1)ヒラメ、その卵又はそれらの加工品から抽出したDNAについて、下記a)又はb)のいずれかのDNAマーカー配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅する工程、
a)配列番号1の809~1158番目の塩基配列(その965~1000位がマイクロサテライト配列に相当する。)
b)配列番号1の507~788番目の塩基配列(その629~750位がマイクロサテライト配列に相当する。)
2)別途継代飼育の結果、低酸素耐性と認められる系統のヒラメについて、上記1)の工程を実施する工程、及び
3)1)と2)の工程の増幅結果を比較し、これらが一致する場合に、ヒラメが低酸素耐性であると識別する工程

【請求項2】
前記工程1)における増幅がPCR反応により行われ、前記工程3)における増幅結果の比較が、増幅されたDNA断片をゲル電気泳動により分離して、その長さを比較することにより行われ、その長さが一致する場合に増幅結果が一致したとする、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
下記工程から成る低酸素耐性ヒラメの識別方法。
1)ヒラメ、その卵又はその加工品から抽出したDNAについて、(1)又は(2)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR反応を行う工程、及び
(1)5'-CATGTTGGTCTGAGACGATGAACTC-3' (配列番号2)の3'側末端から連続する少なくとも18個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-TAGATCCTGTTGTTTTCCTGCTCG-3' (配列番号3)の3'側末端から連続する少なくとも18個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の2つのオリゴヌクレオチド、
(2)5'-CTCACTGTTCTGAAGCTTCTCT-3' (配列番号4)の3'側末端から連続する少なくとも18個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-CGTCTGAGTCGGAATCCTTCTG-3' (配列番号5)の3'側末端から連続する少なくとも18個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の2つのオリゴヌクレオチド
2)(1)の2つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた場合に、PCR産物のゲル電気泳動において119bpのバンドがある場合、又は(2)の2つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた場合に、PCR産物のゲル電気泳動において217bpのバンドがある場合に、ヒラメが低酸素耐性であると識別する工程

【請求項4】
ヒラメが低酸素耐性であるか否かを識別するための診断キットであって、下記いずれかの配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅するためのPCR用プライマーを含むキット。
a)配列番号1の809~1158番目の塩基配列(その965~1000位がマイクロサテライト配列に相当する。)
b)配列番号1の507~788番目の塩基配列(その629~750位がマイクロサテライト配列に相当する。)

【請求項5】
前記PCR用プライマーが、
下記a-1)の塩基配列から成るオリゴヌクレオチド、及びa-2)の塩基配列から成るオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の2つのオリゴヌクレオチド
a-1)配列番号1の1~964番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
a-2)配列番号1の1001~1303番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
又は下記b-1)の塩基配列から成るオリゴヌクレオチド、及びb-2)の塩基配列から成るオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の2つのオリゴヌクレオチド
b-1)配列番号1の1~628番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
b-2)配列番号1の751~1030番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
から成る請求項に記載のキット

【請求項6】
前記PCR用プライマーが、下記いずれかである請求項4に記載のキット
(1)5'-CATGTTGGTCTGAGACGATGAACTC-3' (配列番号2)の3'側末端から連続する少なくとも18個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-TAGATCCTGTTGTTTTCCTGCTCG-3' (配列番号3)の3'側末端から連続する少なくとも18個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の2つのオリゴヌクレオチド
(2)5'-CTCACTGTTCTGAAGCTTCTCT-3' (配列番号4)の3'側末端から連続する少なくとも18個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-CGTCTGAGTCGGAATCCTTCTG-3' (配列番号5)の3'側末端から連続する少なくとも18個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の2つのオリゴヌクレオチド
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録


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