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マルチプレックス遺伝子解析によるエビ類の健康診断法

国内特許コード P150011380
整理番号 S2013-0367-N0
掲載日 2015年2月20日
出願番号 特願2013-014265
公開番号 特開2014-143949
出願日 平成25年1月29日(2013.1.29)
公開日 平成26年8月14日(2014.8.14)
発明者
  • 伊丹 利明
  • 木原 啓輔
  • 稲田 真理
  • 酒井 正博
  • 河野 智哉
出願人
  • 国立大学法人 宮崎大学
発明の名称 マルチプレックス遺伝子解析によるエビ類の健康診断法
発明の概要 【課題】エビ類の健康状態を多検体について同時にかつ迅速に診断する手段を提供すること。
【解決手段】エビ類から採取した被検試料における生体防御関連遺伝子群(Toll経路およびIMD経路、JAK/STAT経路、アポトーシス関連経路、RNA干渉経路、フリーラジカル生成経路、および抗菌ペプチド生成経路の遺伝子、ならびにサイトカイン関連遺伝子)の発現量を測定する工程と、測定された前記生体防御関連遺伝子の発現量に基づいて、エビ類の健康状態を診断する工程を含むエビ類の健康診断方法、ならびに該方法に使用するプライマーセット。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要



クルマエビをはじめとするエビ類の養殖産業は東南アジアや中南米をはじめ世界各地で盛んである。その一方、エビ類養殖では生産効率を上げるために、高密度で飼育する集約養殖が主流であり、抗生物質や栄養剤など様々な化学薬品が投与されているため、養殖池の環境が悪化している。また、1980年代頃から、東南アジアの主要エビ生産国で、ウイルス病の流行が繰り返されている。なかでも、クルマエビ急性ウイルス血症[PAV:penaeid acute viremia、ホワイトスポット病(WSS:white spot syndrome)]は、日本をはじめとするアジア諸国、さらに中南米の養殖クルマエビに発生し、甚大な被害をもたらしている。特に、7月~9月の高水温期では、台風等の集中豪雨によるpHや塩分濃度の低下、底質への残渣、残餌、糞及び脱皮殻等の堆積と腐泥化が原因となって、水質と底質が悪化し、これによってエビ類の免疫力が低下し、海水中に常在するビブリオ菌などによってエビ類が日和見感染をおこし、さらに被害が深刻化する。





このようなウイルス病や細菌病、および養殖場の環境悪化は、エビ養殖の生産量を減少させることになるのでその対応策が必要である。ウイルス病による被害は、死亡エビを発見した時点では、すでに養殖池全体に感染が広がっている場合が多い。これは、エビ類の共食いの習性によるもので、死亡エビを摂食することで健康エビに感染が急激に拡大していく。ウイルス病に対しては、現在は積極的な対処法がなく、ウイルスに感染した稚エビを養殖池に入れないことが重要な対応策となっている。しかし、多くのエビ養殖池は露地池(素掘りの池)で海岸近くに位置するため、天然海域でウイルスに感染したカニやエビが養殖池に侵入して、継続的にウイルス感染を起こす。また、日和見感染による細菌性疾病は、ウイルス感染のように一度に多くの死亡エビは発生しないが、長期間にわたって死亡が続き、収穫時点で初めてその被害の大きさに気付くことも少なくない。しかしながら、このような細菌病に対して水産用医薬品として認可された薬剤がないため、抗生剤等の投薬もできず、積極的な対応策がないのが現状である。また、積極的な対応策ではないが、免疫力を高め病気に対する抵抗力の増強を目的として、天然物由来の免疫賦活剤投与が行なわれているものの、免疫賦活剤の投与だけでは、疾病の完全な制御は難しい。





以上のように、現状でのエビ養殖では、ウイルス病および細菌病の発生を抑制できる有効な手段がない。そのため、適切なエビ養殖を持続的に発展させるためには、エビの健康状態の把握と疾病の早期発見が不可欠である。





エビ類をはじめとする無脊椎動物では獲得免疫が欠除しているため、自然免疫を主とした免疫反応を介して生体防御を行っており、病原体の排除を目的として、様々な免疫応答システムが存在している。ショウジョウバエを例にすると真菌を注入した際にToll経路というシグナル伝達経路が活性化されて、ドロソマイシンという真菌に作用する抗菌ペプチドが産生される。このLysozyme、ALF2などの抗菌ペプチドはクルマエビなどのエビ類を初めとする全ての動物から一部の植物まで使われている生体防御因子で、微生物の侵入によって産生が誘導され、免疫反応の後期で最も大きな役割を果たすと考えられている。また細胞がウイルスに感染時においては、アポトーシス関連因子により自らプログラムを起動し、他に被害を及ぼさないように自殺して自己犠牲を行うことによってウイルスを体内から排除している。その他の生体防御機構として、Nox、NOSなどのフリーラジカル関連因子がある。これらは病原体の侵入やストレス、紫外線を起因に酸素や窒素を殺菌・殺ウイルス能をもつ活性窒素種(RNS)活性酸素種(ROS)に変える働きをもつものである。





エビ類の生体防御機構においても、このような宿主による病原体認識から、シグナル伝達およびそれらの間のクロストークを経て、アポトーシス誘導や抗菌ペプチド等の抗菌分子の産生に至る一連の動的関連性が存在している。よって、そのようなエビ類の生体防御機構の解明および制御は、疾病の根本的防除を目的とした薬剤を開発する上で不可欠である。





本発明者らは、クルマエビを対象として上記のような生体防御関連遺伝子(Toll, NOS, Nox, Duox, Croquemort, ALF2など)のクローニングおよび同定を行なうとともに(非特許文献1~3)、それらの生体防御関連遺伝子を網羅的に解析するために、複数の遺伝子の発現定量解析を同時に行なうことのできるマルチプレックス遺伝子発現定量解析法の開発とそれに用いるプライマーデザインの設計を進めてきた。しかしながら、エビ類の健康状態を正確に反映する遺伝子群を多検体について同時にかつ迅速に定量解析できるシステムを構築するには至っていない。

産業上の利用分野



本発明は、マルチプレックス遺伝子解析によるエビ類の健康状態の診断方法、および当該方法を実施するために用いるプライマーセットに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
下記の工程を含む、エビ類の健康状態の診断方法。
(1) エビ類から採取した被検試料における、Toll(配列番号1)、Toll2(配列番号2)、Tollip(配列番号3)、IMD(配列番号4)、Relish(配列番号5)、STAT(配列番号6)、Socs(配列番号7)、Croquemort(配列番号8)、ASK1(配列番号9)、JNK(配列番号10)、p38(配列番号11)、p53(配列番号12)、IAP(配列番号13)、Caspase3(配列番号14)、Wengen(配列番号15)、Argonaute1(配列番号16)、Argonaute2(配列番号17)、Dicer1(配列番号18)、Dicer2(配列番号19)、NOS(配列番号20)、Nox(配列番号21)、Duox(配列番号22)、Aox(配列番号23)、ALF2(配列番号24)、Crustin(配列番号25)、Lysozyme(配列番号26)、Astakine(配列番号27)、Cyclophilin-A(配列番号28)、HDGF(配列番号29)、 MIF(配列番号30)、PD-ECGF(配列番号31)、VEGF(配列番号32)、VEGF2(配列番号33)、VEGF-Rcp(配列番号34)、BMP(配列番号35)、及びMyostatin(配列番号36)から成る群から選択される少なくとも1種の生体防御関連遺伝子の発現量を測定する工程
(2) 測定された前記生体防御関連遺伝子の発現量に基づいて、エビ類の健康状態を診断する工程

【請求項2】
前記生体防御関連遺伝子の発現量が、該遺伝子より転写されるmRNA量から測定される、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
前記mRNA量の発現量が、RT-PCR法またはリアルタイムRT-PCR法により測定される、請求項2に記載の方法。

【請求項4】
前記RT-PCRがマルチプレックスRT-PCRである、請求項3に記載の方法。

【請求項5】
以下の(p1)~(p37)に記載のプライマーセットから成る群から選択される少なくとも1種のプライマーセットを用いて遺伝子を増幅する、請求項4に記載の方法。
(p1)配列番号38に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号39に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるToll遺伝子増幅用プライマーセット
(p2)配列番号40に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号41に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるToll2遺伝子増幅用プライマーセット
(p3)配列番号42に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号43に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるTollip遺伝子増幅用プライマーセット
(p4)配列番号44に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号45に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるIMD遺伝子増幅用プライマーセット
(p5)配列番号46に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号47に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるRelish遺伝子増幅用プライマーセット
(p6)配列番号48に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号49に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるSTAT遺伝子増幅用プライマーセット
(p7)配列番号50に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号51に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるSocs遺伝子増幅用プライマーセット
(p8)配列番号52に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号53に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるCroquemort遺伝子増幅用プライマーセット
(p9)配列番号54に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号55に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるASK1遺伝子増幅用プライマーセット
(p10)配列番号56に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号57に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるJNK遺伝子増幅用プライマーセット
(p11)配列番号58に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号59に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるp38遺伝子増幅用プライマーセット
(p12)配列番号60に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号61に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるp53遺伝子増幅用プライマーセット
(p13)配列番号62に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号63に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるIAP遺伝子増幅用プライマーセット
(p14)配列番号64に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号65に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるCaspase3遺伝子増幅用プライマーセット
(p15)配列番号66に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号67に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるWengen遺伝子増幅用プライマーセット
(p16)配列番号68に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号69に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるArgonaute1遺伝子増幅用プライマーセット
(p17)配列番号70に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号71に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるArgonaute2遺伝子増幅用プライマーセット
(p18)配列番号72に示す塩基配列からなるプライマーと配列番73に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるDicer1遺伝子増幅用プライマーセット
(p19)配列番号74に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号75に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるDicer2遺伝子増幅用プライマーセット
(p20)配列番号76に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号77に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるNOS遺伝子増幅用プライマーセット
(p21)配列番号78に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号79に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるNox遺伝子増幅用プライマーセット
(p22)配列番号80に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号81に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるDuox遺伝子増幅用プライマーセット
(p23)配列番号82に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号83に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるAox遺伝子増幅用プライマーセット
(p24)配列番号84に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号85に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるALF2遺伝子増幅用プライマーセット
(p25)配列番号86に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号87に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるCrustin遺伝子増幅用プライマーセット
(p26)配列番号88に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号89に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるLysozyme遺伝子増幅用プライマーセット
(p27)配列番号90に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号91に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるAstakine遺伝子増幅用プライマーセット
(p28)配列番号92に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号93に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるCyclophilin-A遺伝子増幅用プライマーセット
(p29)配列番号94に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号95に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるHDGF遺伝子増幅用プライマーセット
(p30)配列番号96に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号97に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるMIF遺伝子増幅用プライマーセット
(p31)配列番号98に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号99に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるPD-ECGF遺伝子増幅用プライマーセット
(p32)配列番号100に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号101に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるVEGF遺伝子増幅用プライマーセット
(p33)配列番号102に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号103に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるVEGF2遺伝子増幅用プライマーセット
(p34)配列番号104に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号105に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるVEGF-Rcp遺伝子増幅用プライマーセット
(p35)配列番号106に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号107に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるVEGF-Rcp-STYKc遺伝子増幅用プライマーセット
(p36)配列番号108に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号109に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるBMP遺伝子増幅用プライマーセット
(p37)配列番号110に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号111に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるMyostatin遺伝子増幅用プライマーセット

【請求項6】
前記工程(2)において、被検試料における遺伝子発現量と対照試料における遺伝子発現量とを比較することにより遺伝子の発現量を解析し、それによりエビ類の健康状態を診断する、請求項1~5のいずれかに記載の方法。

【請求項7】
以下の(p1)~(p37)のエビ類の健康状態診断用プライマーセット。
(p1)配列番号38に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号39に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるToll遺伝子増幅用プライマーセット
(p2)配列番号40に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号41に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるToll2遺伝子増幅用プライマーセット
(p3)配列番号42に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号43に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるTollip遺伝子増幅用プライマーセット
(p4)配列番号44に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号45に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるIMD遺伝子増幅用プライマーセット
(p5)配列番号46に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号47に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるRelish遺伝子増幅用プライマーセット
(p6)配列番号48に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号49に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるSTAT遺伝子増幅用プライマーセット
(p7)配列番号50に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号51に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるSocs遺伝子増幅用プライマーセット
(p8)配列番号52に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号53に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるCroquemort遺伝子増幅用プライマーセット
(p9)配列番号54に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号55に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるASK1遺伝子増幅用プライマーセット
(p10)配列番号56に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号57に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるJNK遺伝子増幅用プライマーセット
(p11)配列番号58に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号59に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるp38遺伝子増幅用プライマーセット
(p12)配列番号60に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号61に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるp53遺伝子増幅用プライマーセット
(p13)配列番号62に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号63に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるIAP遺伝子増幅用プライマーセット
(p14)配列番号64に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号65に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるCaspase3遺伝子増幅用プライマーセット
(p15)配列番号66に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号67に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるWengen遺伝子増幅用プライマーセット
(p16)配列番号68に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号69に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるArgonaute1遺伝子増幅用プライマーセット
(p17)配列番号70に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号71に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるArgonaute2遺伝子増幅用プライマーセット
(p18)配列番号72に示す塩基配列からなるプライマーと配列番73に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるDicer1遺伝子増幅用プライマーセット
(p19)配列番号74に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号75に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるDicer2遺伝子増幅用プライマーセット
(p20)配列番号76に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号77に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるNOS遺伝子増幅用プライマーセット
(p21)配列番号78に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号79に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるNox遺伝子増幅用プライマーセット
(p22)配列番号80に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号81に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるDuox遺伝子増幅用プライマーセット
(p23)配列番号82に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号83に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるAox遺伝子増幅用プライマーセット
(p24)配列番号84に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号85に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるALF2遺伝子増幅用プライマーセット
(p25)配列番号86に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号87に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるCrustin遺伝子増幅用プライマーセット
(p26)配列番号88に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号89に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるLysozyme遺伝子増幅用プライマーセット
(p27)配列番号90に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号91に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるAstakine遺伝子増幅用プライマーセット
(p28)配列番号92に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号93に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるCyclophilin-A遺伝子増幅用プライマーセット
(p29)配列番号94に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号95に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるHDGF遺伝子増幅用プライマーセット
(p30)配列番号96に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号97に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるMIF遺伝子増幅用プライマーセット
(p31)配列番号98に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号99に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるPD-ECGF遺伝子増幅用プライマーセット
(p32)配列番号100に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号101に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるVEGF遺伝子増幅用プライマーセット
(p33)配列番号102に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号103に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるVEGF2遺伝子増幅用プライマーセット
(p34)配列番号104に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号105に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるVEGF-Rcp遺伝子増幅用プライマーセット
(p35)配列番号106に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号107に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるVEGF-Rcp-STYKc遺伝子増幅用プライマーセット
(p36)配列番号108に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号109に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるBMP遺伝子増幅用プライマーセット
(p37)配列番号110に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号111に示す塩基配列からなるプライマーとから構成されるMyostatin遺伝子増幅用プライマーセット

【請求項8】
配列番号1~36のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための少なくとも15塩基以上の長さを有するエビ類の健康状態診断用プローブ。

【請求項9】
請求項7に記載のプライマーセットを少なくとも含む、エビ類の健康状態診断用キット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開


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