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ステロイドホルモン膜受容体の精製方法

国内特許コード P150011504
整理番号 S2013-1110-N0
掲載日 2015年3月6日
出願番号 特願2013-136980
公開番号 特開2015-010064
出願日 平成25年6月28日(2013.6.28)
公開日 平成27年1月19日(2015.1.19)
発明者
  • 徳元 俊伸
  • 大島 卓之
出願人
  • 国立大学法人静岡大学
発明の名称 ステロイドホルモン膜受容体の精製方法
発明の概要 【課題】ステロイド膜受容体を標的とする物質のスクリーニングのための、より簡便な手法を提供する。より具体的には、ステロイドホルモン結合活性を有するステロイド膜受容体を精製する方法を提供する。
【解決手段】ステロイド膜受容体を発現できるように、ステロイド膜受容体をコードする遺伝子を細胞に導入し、遺伝子組換え細胞を得る工程と、遺伝子組換え細胞を培養し、ステロイド膜受容体を発現させる工程と、ステロイド膜受容体を含む膜画分を回収し、ステロイド膜受容体を精製する工程とを含む、ステロイド膜受容体の精製方法。
【選択図】図6
従来技術、競合技術の概要



ステロイドホルモンの一種である17α,20β-dihydroxy-4-prognen-3-one(17,20β-DHP)は、魚類の卵成熟誘起ホルモンとして知られている。膜受容体を介した魚類の卵成熟誘導機構に関する研究において、ステロイド膜受容体の候補であるプロゲスチン膜受容体(membrane progestin receptor;mPR)が発見され、脳や腎臓等様々な組織で発現していることが明らかになった(非特許文献1及び2)。





mPRは、7回膜貫通型受容体であり、脊髄動物細胞に保存されている、AdipoQ受容体と相同性を示す11遺伝子からなる新規Gタンパク質共役受容体ファミリーを形成し、progestin and adipoQ receptors(PAQR)ファミリーと命名されている。mPR分子はα、β、γ、δ、及びεの5種類を有し、それぞれPAQR7、8、5、6及び9に対応する(非特許文献3及び4)。





化学物質とステロイド膜受容体との相互作用の検討は、創薬研究において重要なアプローチとなっている。現状このような創薬研究は、膜受容体遺伝子を導入した培養細胞又はその細胞膜画分を用いた技術によって評価されている。ステロイド膜受容体に作用する薬物候補のスクリーニングは、生細胞を用いるためホルモン刺激による生体反応を検定できるとのメリットがある。同時に、培養細胞におけるステロイド膜受容体の発現量が低いことや、ラジオアイソトープの使用、細胞膜画分の都度調製の必要があることなどのデメリットがある。また、細胞培養のコストが高いため、多検体をスクリーニングするための実用化は困難と考えられる。

産業上の利用分野



本発明は、ステロイドホルモン膜受容体の精製方法、特に遺伝子組み換え細胞において発現されたステロイドホルモン膜受容体の精製方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
ステロイド膜受容体を発現できるように、ステロイド膜受容体をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、遺伝子組換え細胞を得る工程と、
遺伝子組換え細胞を培養し、ステロイド膜受容体を発現させる工程と、
ステロイド膜受容体を含む膜画分を回収し、ステロイド膜受容体を精製する工程と
を含む、ステロイド膜受容体の精製方法。

【請求項2】
前記ステロイド膜受容体がプロゲスチン受容体(mPR)である、請求項1に記載の精製方法。

【請求項3】
前記ステロイド膜受容体が、プロゲスチン受容体(mPR)α、β、γ、δ、又はεである、請求項1又は2に記載の精製方法。

【請求項4】
前記宿主細胞が、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項1~3のいずれか一項に記載の精製方法。

【請求項5】
精製工程は、アフィニティークロマトグラフィーによって行われる、請求項1~4のいずれか一項に記載の精製方法。

【請求項6】
前記アフィニティークロマトグラフィーが、Hisタグ、c-Mycタグ、GSTタグ、MBPタグ、FLAGタグ、HQタグ、HNタグ、HATタグ及びV5タグから選択されるタグを利用したものである、請求項5に記載の精製方法。

【請求項7】
精製工程が、アミノ基が付加されたセルロースゲルによって行われる、請求項1~6のいずれか一項に記載の精製方法。

【請求項8】
前記アミノ基が付加されたセルロースゲルが、セルファイン(登録商標)アミノである、請求項7に記載の精製方法。

【請求項9】
前記セルファイン(登録商標)アミノが、リガンドが固定されることなく精製に使用される、請求項8に記載の精製方法。

【請求項10】
請求項1~9のいずれか一項に記載の精製方法によって精製されたステロイド膜受容体。

【請求項11】
ステロイド膜受容体を標的とする物質のスクリーニングにおける、請求項10に記載のステロイド膜受容体を使用する、方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2013136980thum.jpg
出願権利状態 公開
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