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遺伝子ターゲティングベクター、その作製方法及び利用方法 新技術説明会

国内特許コード P150011932
掲載日 2015年4月24日
出願番号 特願2013-518006
登録番号 特許第5999602号
出願日 平成24年5月24日(2012.5.24)
登録日 平成28年9月9日(2016.9.9)
国際出願番号 JP2012063248
国際公開番号 WO2012165270
国際出願日 平成24年5月24日(2012.5.24)
国際公開日 平成24年12月6日(2012.12.6)
優先権データ
  • 特願2011-118564 (2011.5.27) JP
発明者
  • 足立 典隆
出願人
  • 公立大学法人横浜市立大学
発明の名称 遺伝子ターゲティングベクター、その作製方法及び利用方法 新技術説明会
発明の概要 効率が高い遺伝子ターゲティングを可能とする遺伝子ターゲティングベクターを提供する。
バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が選択用マーカーの5’上流に存在することを特徴とする遺伝子ターゲティングベクター。標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が5’上流に存在する選択用マーカー及び標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片を連結することを含む、遺伝子ターゲティングベクターを作製する方法。
従来技術、競合技術の概要



細胞が備えている相同組換え能を利用して、ゲノム上の特定の遺伝子だけを破壊、ないし人為的に導入したDNA断片と置き換えることができる(非特許文献1、2)。これを遺伝子ターゲティングと呼ぶ。この手法は、個々の遺伝子機能解析に絶大な威力を発揮してきただけでなく、理想的な遺伝子治療法や品種改良法としても期待されている(非特許文献3)。しかし、一般的な高等動植物細胞における遺伝子ターゲティングの効率は極めて低く、改良法の開発が望まれている。プロモーターレス型(エクソントラップ型も含む。)のターゲティングベクターを用いることで効率の上昇が見込める(非特許文献4、5)が、汎用されているIRES配列では細胞内での発現レベルの低い遺伝子(プロモーター活性の弱い遺伝子)がトラップされにくいため、改良法の開発が求められていた。

産業上の利用分野



本発明は、遺伝子ターゲティングベクター、その作製方法及び利用方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が5’上流に存在する選択用マーカー及び標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片を連結することを含む、遺伝子ターゲティングベクターを作製する方法であって、選択用マーカーはそのマーカー独自のプロモーターを持たないが、標的遺伝子とのバイシストロン性発現により発現がオンになり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES、IRES2及び2Aペプチド配列からなる群より選択される少なくとも1つである前記方法。

【請求項2】
標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片がスプライスアクセプター部位を含む請求項1記載の方法。

【請求項3】
標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片又は標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片がリニア化部位を含む請求項1又は2記載の方法。

【請求項4】
バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が選択用マーカーの5’上流に存在することを特徴とする遺伝子ターゲティングベクターであって、選択用マーカーはそのマーカー独自のプロモーターを持たないが、標的遺伝子とのバイシストロン性発現により発現がオンになり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES、IRES2及び2Aペプチド配列からなる群より選択される少なくとも1つである前記ベクター。

【請求項5】
選択用マーカーがポリA配列を持つが、プロモーターを持たない請求項4記載のベクター。

【請求項6】
選択用マーカーが部位特異的組換え酵素の標的配列で挟まれている請求項4又は5記載のベクター。

【請求項7】
さらにスプライスアクセプター部位が導入されている請求項4~6のいずれかに記載のベクター。

【請求項8】
さらにリニア化部位が導入されている請求項4~7のいずれかに記載のベクター。

【請求項9】
請求項4~8のいずれかに記載の遺伝子ターゲティングベクターを用いて、細胞に遺伝子変異を導入することを含む、遺伝子ノックアウト細胞を作製する方法(in vivoのヒトでの方法を除外する)

【請求項10】
遺伝子ターゲティングベクターを作製するために使用する選択用マーカーを含んでいるベクターであって、選択用マーカーの5'上流にバイシストロン性発現を可能にするDNA配列が組み込まれ、かつ、選択用マーカーはそのマーカー独自のプロモーターを持たず、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES、IRES2及び2Aペプチド配列からなる群より選択される少なくとも1つである前記ベクター。

【請求項11】
さらにスプライスアクセプター部位が導入されている請求項10記載のベクター。

【請求項12】
選択用マーカーが、ピューロマイシン耐性遺伝子及び/又はハイグロマイシン耐性遺伝子であり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES配列及び/又は2Aペプチド配列である請求項1記載の方法。

【請求項13】
選択用マーカーが、ピューロマイシン耐性遺伝子及び/又はハイグロマイシン耐性遺伝子であり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES配列及び/又は2Aペプチド配列である請求項4記載のベクター。

【請求項14】
請求項13記載の遺伝子ターゲティングベクターを用いて、細胞に遺伝子変異を導入することを含む、遺伝子ノックアウト細胞を作製する方法(in vivoのヒトでの方法を除外する)
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2013518006thum.jpg
出願権利状態 登録
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