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羊膜間葉系細胞組成物の製造方法及び凍結保存方法、並びに治療剤

国内特許コード P150012255
掲載日 2015年9月4日
出願番号 特願2014-130142
公開番号 特開2015-061520
出願日 平成26年6月25日(2014.6.25)
公開日 平成27年4月2日(2015.4.2)
優先権データ
  • 特願2013-170008 (2013.8.19) JP
発明者
  • 山原 研一
  • 田口 明彦
  • 相馬 俊裕
  • 大西 俊介
  • 小林 明
出願人
  • 国立研究開発法人国立循環器病研究センター
  • 公益財団法人先端医療振興財団
  • 学校法人兵庫医科大学
  • 国立大学法人北海道大学
  • 株式会社カネカ
発明の名称 羊膜間葉系細胞組成物の製造方法及び凍結保存方法、並びに治療剤
発明の概要 【課題】一回の酵素処理のみで、簡便かつ無菌的に高純度な羊膜由来MSCを分離することによる間葉系細胞組成物の製造方法を提供すること。
【解決手段】羊膜を、コラゲナーゼと、サーモリシン及び/又はディスパーゼとにより酵素処理する工程;及び酵素処理した羊膜をメッシュに通す工程を含む、間葉系細胞組成物の製造方法;凍結保存された間葉系細胞組成物の製造方法;並びに前記間葉系細胞組成物を有効成分とする移植片対宿主病・炎症性腸疾患・全身性エリテマトーデス・肝硬変・放射線腸炎治療剤。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要



間葉系幹細胞は、骨髄に存在することが指摘された体性幹細胞であり、幹細胞として骨、軟骨及び脂肪に分化する能力を有する。間葉系幹細胞は、細胞治療における有望な細胞ソースとして注目され、最近では、胎盤、臍帯、卵膜などの胎児付属物にも存在することが知られている。





現在、間葉系幹細胞は、分化能以外に免疫抑制能を有することで注目されており、骨髄由来間葉系幹細胞を用い、造血幹細胞移植における急性移植片対宿主病(GVHD)、及び炎症性腸疾患のCrohn病に対する治験が進んでいる。本発明者らは胎児付属物由来間葉系幹細胞の免疫関連疾患に対する臨床応用を目指した研究を進めてきた。これまでに本発明者らは、胎児付属物由来間葉系幹細胞が骨髄由来間葉系幹細胞と同様の分化能を有すること(非特許文献6)、卵膜由来間葉系幹細胞がラット自己免疫性心筋炎モデルの病態を改善すること(非特許文献7)、並びに臍帯由来間葉系幹細胞がマウス急性移植片対宿主病(GVHD)モデルの救命率を改善すること(非特許文献8)を報告してきた。胎児付属物由来間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞と比較し、一度に多くの間葉系幹細胞が得られ、大量培養が短期間・低コストに可能であり、非侵襲的に採取可能であり、免疫抑制効果も高い(非特許文献7)。これらのことから、胎児付属物由来間葉系幹細胞を含むMSCは、その著明な免疫抑制効果により、様々な免疫関連疾患を対象とした細胞治療に応用可能である。





これまでに、胎児付属物である卵膜、胎盤および羊水から、多能性ヒト胎児由来幹細胞を取得する方法が報告されている(特許文献1)。特許文献1では、これら幹細胞をc-kit(CD117)陽性と位置づけ、フローサイトメトリーにより分離する方法が記載されている。また、胎盤および臍帯から、成人または小児の様々な細胞に分化する能力を有する幹細胞・前駆細胞を取得する方法も報告されている(特許文献2)。特許文献2では、様々な臓器や組織を構成する細胞に分化する能力を有する(=間葉系幹細胞以上の分化能力を有する)幹細胞・前駆細胞が胎盤および臍帯に含まれており、その分離に関する方法が記載されている。





これら胎児付属物由来の幹細胞および前駆細胞を含む細胞分離には、一般にトリプシン、コラゲナーゼ又はディスパーゼ等の分解酵素が用いられている(特許文献1及び2、非特許文献1~4)。胎児付属物のうち卵膜は、羊水に接し最も胎児側に位置する羊膜と、その外側に位置する絨毛膜とに分けられ、卵膜(羊膜および絨毛膜)由来のMSCも分解酵素を用いて分離する方法が一般的である(非特許文献1及び4)。





胎児付属物の卵膜の一部である羊膜は、羊水に接する上皮細胞層と、その下にあるMSCを含む細胞外基質層とに分けられる(図1)。そのため、羊膜全体をトリプシンにて処理した場合、細胞外基質層のみならず上皮細胞層を支持する基底膜も消化され、結果、上皮細胞とMSCの混合物となるという問題があった。この問題の解決方法としては、非特許文献1~3のように、羊膜からMSCを高純度に分離するために、分解酵素や用手的に上皮細胞を先に取り除き、残った細胞外基質層を再度分離酵素で処理し、MSCを回収する方法がある。しかし、これらの方法では、完全には上皮細胞を除去できない、又はMSCの回収量が下がるという問題があった。





更に、卵膜MSCをオンデマンドで細胞治療用に使用するには、凍結保存が必須である。研究レベルではジメチルスルホキシド(DMSO)をベースとした各種の細胞凍結保存液が市販され、骨髄MSCの臨床試験でもDMSOを10%含有した凍結保存液が用いられているが、解凍後の細胞の生存率が下がるという問題があった。

産業上の利用分野



本発明は、羊膜から、細胞治療応用に適した間葉系細胞(Mesenchymal stromal cell:MSC)を高純度かつ簡便に分離することによる間葉系細胞組成物の製造方法に関する。さらに本発明は、凍結保存された間葉系細胞組成物の製造方法、並びに間葉系細胞組成物を含む治療剤に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
羊膜を、コラゲナーゼと、サーモリシン及び/又はディスパーゼとにより酵素処理する工程;及び
酵素処理した羊膜をメッシュに通す工程:
を含む、間葉系細胞組成物の製造方法。

【請求項2】
メッシュを通過した細胞を回収する工程;及び
回収した細胞を培養する工程:
をさらに含む、請求項1に記載の間葉系細胞組成物の製造方法。

【請求項3】
前記メッシュを通過した細胞を回収する工程が、倍量又はそれ以上の量の培地又は平衡塩溶液で濾液を希釈した後、遠心分離により間葉系細胞を回収する工程である、請求項2に記載の間葉系細胞組成物の製造方法。

【請求項4】
コラゲナーゼの濃度が50CDU/ml~1000CDU/mlであり、サーモリシンおよび/又はディスパーゼの濃度が100PU/ml~800PU/mlである、請求項1から3の何れか1項に記載の間葉系細胞組成物の製造方法。

【請求項5】
酵素処理する工程が、30~40℃で30分以上処理する工程である、請求項1から4の何れか1項に記載の間葉系細胞組成物の製造方法。

【請求項6】
酵素処理する工程が、スターラー又はシェーカーを用いて10rpm/分~100rpm/分で30分以上撹拌する工程である、請求項1から5の何れか1項に記載の間葉系細胞組成物の製造方法。

【請求項7】
羊膜が帝王切開により得られたものである、請求項1から6の何れか1項に記載の間葉系細胞組成物の製造方法。

【請求項8】
メッシュのポアサイズが40~200μmである、請求項1から7の何れか1項に記載の間葉系細胞組成物の製造方法。

【請求項9】
酵素処理した羊膜をメッシュに通す工程が自然落下である、請求項1から8の何れか1項に記載の間葉系細胞組成物の製造方法。

【請求項10】
CD324及びCD326陽性上皮細胞の含有率が20%以下であり、CD90陽性細胞の含有率が75%以上であり、および生細胞率が80%以上である、間葉系細胞組成物。

【請求項11】
請求項1から9の何れか1項に記載の間葉系細胞組成物の製造方法により得られる、請求項10に記載の間葉系細胞組成物。

【請求項12】
請求項10又は11に記載の間葉系細胞組成物を0.05質量%より多く5質量%以下のアルブミンを含有する培地にて培養することにより得られる、間葉系細胞培養組成物。

【請求項13】
ジメチルスルホキシドを5~10質量%含有し、ヒドロキシルエチルデンプンを5~10質量%またはデキストランを1~5質量%含有する溶液中に間葉系細胞を含む混合物を凍結保存する工程を含む、凍結保存された間葉系細胞の製造方法。

【請求項14】
前記溶液が、さらにヒトアルブミンを0質量%より多く5質量%以下含有する溶液である、請求項13に記載の凍結保存された間葉系細胞の製造方法。

【請求項15】
前記間葉系細胞が、請求項1から9の何れか1項に記載の方法により製造された間葉系細胞組成物に含まれる間葉系細胞、請求項10又は11に記載の間葉系細胞組成物に含まれる間葉系細胞、又は請求項12に記載の間葉系細胞培養組成物に含まれる間葉系細胞である、請求項13又は14に記載の凍結保存された間葉系細胞の製造方法。

【請求項16】
請求項13から15の何れか1項に記載の方法により得られる凍結保存された間葉系細胞を解凍後、輸液製剤により2倍以上に希釈する工程を含む、間葉系細胞投与用組成物を製造する方法。

【請求項17】
請求項10又は11に記載の間葉系細胞組成物、および/又は請求項12に記載の間葉系細胞培養組成物、および/又は請求項16に記載の方法により製造される間葉系細胞投与用組成物を有効成分として含む、細胞治療剤。

【請求項18】
注射用製剤である、請求項17に記載の細胞治療剤。

【請求項19】
細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、請求項17に記載の細胞治療剤。

【請求項20】
移植片対宿主病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、肝硬変、又は放射線腸炎から選択される疾患の治療剤である、請求項17から19の何れか1項に記載の治療剤。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開


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