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IgY特異的結合ペプチド及びそれによるIgYの精製法

国内特許コード P150012299
整理番号 S2014-0001-N0
掲載日 2015年9月9日
出願番号 特願2013-212343
公開番号 特開2015-073488
出願日 平成25年10月9日(2013.10.9)
公開日 平成27年4月20日(2015.4.20)
発明者
  • 伊東 祐二
出願人
  • 国立大学法人 鹿児島大学
発明の名称 IgY特異的結合ペプチド及びそれによるIgYの精製法
発明の概要 【課題】IgY特異的結合ペプチドを提供する。
【解決手段】式: (X1-3)-C-(X5)-W-(X7-11)-W-(X13)-C-(X15-17)(式中、X1-3のうちX1とX3、及びX15-17は、独立に、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基であり、X2は、システイン残基であってもよい任意のアミノ酸残基であり、Cはシステイン残基であり、X5は、T、D、V、S又はEのアミノ酸残基であり、Wは、トリプトファン残基であり、X7-11は、アミノ酸配列(S、T、R又はN)-(S、A、K又はR)-(I、A、V、T又はG)-(V、Y、T、R又はS)-(G又はD)であり、X13は、V、L、D、S、M、T又はRのアミノ酸残基である)によって表される、17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、4位と14位のシステイン残基間でジスルフィド結合を形成しており、並びに、トリIgYと結合可能であることを特徴とするペプチド、該ペプチドを使用するIgYの分析又は精製方法。
【選択図】図2
従来技術、競合技術の概要



現在、臨床診断や研究用の試薬としての抗体は、マウスのモノクローナル抗体やウサギのポリクローナル抗体が多く使われており、大きな市場を持っている。一方、ニワトリのIgY抗体は、免疫による特異抗体作製方法の確立とともに、試験動物としてのコストの安さ、動物抗体との交差反応の低さに加え、卵黄から非侵襲的にIgYの抗体が精製できることがメリットとして注目され、試薬としての新しい抗体として期待されている。





卵黄からのIgYの精製法として、いくつかの方法が報告されてきた(非特許文献1)。卵黄には、不溶性のリン脂質やリポプロテインが多く含まれており、これらがアフィニティ精製の際の障害となるため、これをPEG、Pectinなどを使った沈殿法によって除くプロトコールが報告されている(非特許文献2)。市販のIgY精製キットも同様な原理を用いたものであり、現在、主なもので、Eggcellent (Thermo Pierce) と EGGstract (Promega)がよく使われている。最近、Sock Hwee Tanらは、plant gums pectinとκ-carrageenanを用いた沈殿法で、市販のものとも、純度や収量で劣らない精製プロトコールを報告した(非特許文献3)。しかし、このような方法においても、精製されるIgYの純度は50~80%程度であり、より高精製度のIgYの調製には、アフィニティカラムの使用が不可欠である。





しかしながら、例えば、ヒトIgGにおけるプロテインAのような、IgYを精製するための特異的なリガンドは、報告されておらず、精製用の合成リガンドが報告されているものの(非特許文献4、あるいはGE Healthcare社の2-mercaptopyridine固定化カラム:HiTrap IgY Purification HP)、精製されたIgY抗体の純度の観点からは、不十分(70%程度)と言わざるを得ない。





本発明者らは、これまで、T7ファージディスプレイシステムによって構築したランダムペプチドライブラリを用いて、ヒトIgGやヒトIgAに特異的に結合するペプチドを単離し、そのペプチドを固定化したアフィニティカラムを使った抗体の精製法を報告してきた(特許文献1、2)。

しかし、IgY結合ペプチドについては、これまで十分な報告がなかった。

産業上の利用分野



本発明は、IgY特異的結合ペプチドに関する。

本発明はまた、該ペプチドによるIgYの精製法を提供する。

特許請求の範囲 【請求項1】
下記の式(I):
(X1-3)-C-(X5)-W-(X7-11)-W-(X13)-C-(X15-17) (I)
(式中、X1-3のうちX1とX3は、独立に、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基であり、X2は、システイン残基であってもよい任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
X5は、T、D、V、S又はEのアミノ酸残基であり、
Wは、トリプトファン残基であり、
X7-11は、アミノ酸配列(S、T、R又はN)-(S、A、K又はR)-(I、A、V、T又はG)-(V、Y、T、R又はS)-(G又はD)であり、
X13は、V、L、D、S、M、T又はRのアミノ酸残基であり、並びに、
X15-17の3個のアミノ酸残基は、独立に、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基である)
によって表される、17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、4位のシステイン残基と14位のシステイン残基との間でジスルフィド結合を形成しており、並びに、トリIgYと結合可能であることを特徴とするペプチド。

【請求項2】
上記のX1-3は、アミノ酸配列(G、R、W、E、A又はV)-(V、T、C、I、W又はN)-(K、R、V、S、T又はW)であることを特徴とする、請求項1に記載のペプチド。

【請求項3】
上記のX1-3が、アミノ酸配列GVK、GTR、RCV、WIR、EWS、GTS、ATT、VNV又はGTWからなる群から選択されることを特徴とする、請求項2に記載のペプチド。

【請求項4】
上記のX15-17は、アミノ酸配列(V、Y、R、F、D、N、S又はG)-(D、N、A、R、T、S、K又はI)-(M、Y、D、S、P、V又はG)であることを特徴とする、請求項1~3のいずれか1項に記載のペプチド。

【請求項5】
上記のX15-17は、アミノ酸配列VDM、YDY、RND、FAS、DRD、NTP、YSV、SKS又はGIGからなる群から選択されることを特徴とする、請求項4に記載のペプチド。

【請求項6】
上記のX5は、T、D又はVであることを特徴とする、請求項1~5のいずれか1項に記載のペプチド。

【請求項7】
上記のX7-11は、アミノ酸配列SSIVD、SAAYG、TAVTG、TKVTG、RKTTG、NRGRG、TRGSG、RSGRG又はRRTSGからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1~6のいずれか1項に記載のペプチド。

【請求項8】
上記のX13は、V、S又はRのアミノ酸残基であることを特徴とする、請求項1~7のいずれか1項に記載のペプチド。

【請求項9】
以下のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項1~8のいずれか1項に記載のペプチド。
GVKCTWSSIVDWVCVDM(配列番号1)
GTRCDWSAAYGWLCYDY(配列番号2)
RCVCVWTAVTGWDCRND(配列番号3)
WIRCDWTKVTGWVCFAS (配列番号4)
EWSCVWRKTTGWSCDRD (配列番号5)
GTSCSWNRGRGWMCNTP (配列番号6)
ATTCTWTRGSGWSCYSV (配列番号7)
VNVCEWRSGRGWTCSKS (配列番号8)
GTWCTWRRTSGWRCGIG (配列番号9)

【請求項10】
標識が結合されている、請求項1~9のいずれか1項に記載のペプチド。

【請求項11】
請求項1~9のいずれか1項に記載のペプチドと連結されたタンパク質からなる融合タンパク質。

【請求項12】
請求項1~9のいずれか1項に記載のペプチドを固相に結合してなる固定化ペプチド。

【請求項13】
請求項1~9のいずれか1項に記載のペプチドをコードする核酸。

【請求項14】
請求項1~9のいずれか1項に記載のペプチド又は請求項12に記載の固定化ペプチドをIgYと結合させること、並びに、結合したIgYを遊離させてIgYを回収することを含む、IgYの精製方法。

【請求項15】
請求項1~9のいずれか1項に記載のペプチド又は請求項12に記載の固定化ペプチドにサンプル中のIgYを結合させ、結合したIgYを検出することを含む、IgYの検出方法。

【請求項16】
請求項1~9のいずれか1項に記載のペプチド又は請求項12に記載の固定化ペプチドの少なくとも1種を含む、IgYの分析又は精製のためのキット。

【請求項17】
請求項12に記載の固定化ペプチドを含有する、IgY分離用カラム。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 公開
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