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海洋バイオマスからのエタノール生産 外国出願あり

国内特許コード P150012396
整理番号 2499
掲載日 2015年10月16日
出願番号 特願2010-550772
登録番号 特許第4845070号
出願日 平成22年8月25日(2010.8.25)
登録日 平成23年10月21日(2011.10.21)
国際出願番号 JP2010064383
国際公開番号 WO2011024858
国際出願日 平成22年8月25日(2010.8.25)
国際公開日 平成23年3月3日(2011.3.3)
優先権データ
  • 特願2009-198972 (2009.8.28) JP
発明者
  • 村田 幸作
  • 河井 重幸
  • 織田 浩司
  • 庵原 啓司
  • 三上 文三
  • 竹田 浩之
  • 米山 史紀
  • 落合 秋人
  • 橋本 渉
出願人
  • 国立大学法人京都大学
  • マルハニチロ株式会社
発明の名称 海洋バイオマスからのエタノール生産 外国出願あり
発明の概要 Sphingomonas sp. A1株が有するアルギン酸資化能とZymomonas mobilis等の細菌が有する強力なエタノール生産能を利用した、褐藻類に多量含有される多糖アルギン酸からのエタノール生産方法の提供。
1つの微生物に、Sphingomonas sp. A1株由来のアルギン酸資化に関するタンパク質及び酵素をコードする遺伝子とエタノール生産に関する酵素をコードする遺伝子を共存させ、該微生物をアルギン酸を含む培地中で培養することを含む、アルギン酸を原料としてエタノールを生産する方法。
従来技術、競合技術の概要


ホンダワラ類等の褐藻は大量増殖が可能であり、かつ食糧資源と競合しないことからバイオ燃料への生産原料として期待されている。しかし、褐藻の主要成分は乾燥藻体の約30~60%含まれるアルギン酸(酸性多糖)である。これまでの研究では、その利用は主に褐藻中のセルロースに焦点があたっており、主成分であるアルギン酸(ウロン酸(主鎖の末端(6位)がカルボキシル化された糖)からなる多糖)のエタノールへの変換法は確立されていなかった。



アルギン酸からエタノールを生産させる技術はこれまで検討されており、体腔形成細菌Sphingomonas sp. A1株(以下A1株)が、アルギン酸から極微量のエタノールを生産することが報告されている(非特許文献1を参照)。しかし、A1株のエタノール生産性は、極めて微量であり、商業ベースでの生産・事業化は極めて困難である。



アルギン酸からのエタノールの代謝経路はこれまである程度明らかにされており、A1株においては、アルギン酸をエンド型とエキソ型リアーゼにより単糖(α-ケト酸)にまで分解し、α-ケト酸還元酵素により2-keto-3-deoxy-D-gluconate (KDG)に変換し、酵素A1-K(キナーゼ)とA1-A(アルドラーゼ)による反応でピルビン酸に変換されることが推定されている(非特許文献2を参照)。ピルビン酸は、好気的条件下においては主にTCA回路に入りATP(エネルギー源)の生産に利用されるが、微好気環境下においてエタノールを生産するものである。



ウロン酸(単糖)からピルビン酸へ至る経路に関しては、Pseudomonas属細菌でも報告されており、α-ケト酸還元酵素の存在が報告されている(非特許文献3及び4を参照)。また、2-keto-3-deoxy-D-gluconate (KDG)の代謝に関する酵素群(KDG-キナーゼ、KDG-アルドラーゼ)やそれら遺伝子は大腸菌で明らかにされている(http://www.genome.jp/dbget-bin/get_pathway?org_name=eco&mapno=00040)。



一方、強力なエタノール生産能を持つ細菌として、グラム陰性細菌Zymomonas mobilis(アルギン酸資化能はない)が知られており、グルコース、フルクトース、スクロースから酵母の2.5倍という高効率でエタノール生産を行うことが報告されている。また、Zymomonas mobilis由来ピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素を大腸菌に組み込み、グルコースからエタノールを生産させる技術について報告されている(特許文献1を参照)。この株はKO11(ATCC55124)株として現在、セルロース系バイオマスからのバイオエタノール生産に工業利用されている。また、大腸菌以外のグラム陰性菌(Erwinia、Klebsiella、Xanthomonas)に組み込むことも報告されている(特許文献2を参照)。

産業上の利用分野


海域由来のバイオマス、とりわけ褐藻類に多量含有される多糖アルギン酸からのエタノール生産を可能ならしめる技術を提供する。

特許請求の範囲 【請求項1】
アルギン酸資化に関するタンパク質及び酵素であるABCトランスポーター、アルギン酸結合タンパク質、エンド型/エキソ型アルギン酸リアーゼ、ケト酸還元酵素、キナーゼ及びアルドラーゼを有するSphingomonas sp. A1株にZymomonas mobilis由来のピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換Sphingomonas sp. A1株を、アルギン酸を含む培地中で培養することを含む、アルギン酸を原料としてエタノールを生産する方法であって、培養3日目から培養液100mL当たり一日一回1gのアルギン酸またはアルギン酸オリゴを培地中に追加し、さらに、5~7日目まで培養することにより、培地中に0.7%(w/v)以上のエタノールが蓄積し得る、方法

【請求項2】
形質転換Sphingomonas sp. A1株がさらに以下の(i)~(iii)の特性の少なくとも一つの特性を有する、請求項1に記載のアルギン酸を原料としてエタノールを生産する方法:
(i) Zymomonas mobilis由来のピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子がSphingomonas sp. A1株由来のSPH2987遺伝子のプロモーターにより制御され高発現する;
(ii) Zymomonas mobilis由来のピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子が多数コピー導入されている;及び
(iii) NADH再生系酵素であるギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子が共存している。

【請求項3】
形質転換Sphingomonas sp. A1株において、さらに乳酸合成に関する遺伝子がノックアウトされている、請求項1または2に記載のアルギン酸を原料としてエタノールを生産する方法。

【請求項4】
固定化した形質転換Sphingomonas sp. A1株を用いる、請求項1~のいずれか1項に記載のアルギン酸を原料としてエタノールを生産する方法。

【請求項5】
アルギン酸資化に関するタンパク質及び酵素であるABCトランスポーター、アルギン酸結合タンパク質、エンド型/エキソ型アルギン酸リアーゼ、ケト酸還元酵素、キナーゼ及びアルドラーゼを有するSphingomonas sp. A1株にZymomonas mobilis由来のピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換Sphingomonas sp. A1株である、培養3日目から培養液100mL当たり一日一回1gのアルギン酸またはアルギン酸オリゴを培地中に追加し、さらに、5~7日目まで培養することにより、培地中に0.7%(w/v)以上のエタノールが蓄積し得る、アルギン酸を原料としてエタノールを生産し得る微生物。

【請求項6】
さらに以下の(i)~(iii)の特性の少なくとも一つの特性を有する、請求項記載の微生物:
(i) Zymomonas mobilis由来のピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子がSphingomonas sp. A1株由来のSPH2987遺伝子のプロモーターにより制御され高発現する;
(ii) Zymomonas mobilis由来のピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子が多数コピー導入されている;及び
(iii) NADH再生系酵素であるギ酸脱水素酵素をコードする遺伝子が共存している。

【請求項7】
さらに乳酸合成に関する遺伝子がノックアウトされている、請求項5または6に記載の微生物。

【請求項8】
アルギン酸資化に関するタンパク質及び酵素であるABCトランスポーター、アルギン酸結合タンパク質、エンド型/エキソ型アルギン酸リアーゼ、ケト酸還元酵素、キナーゼ及びアルドラーゼを有するSphingomonas sp. A1株にZymomonas mobilis由来のピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を導入し、Zymomonas mobilis由来のピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子がSphingomonas sp. A1株由来のSPH2987遺伝子のプロモーターにより制御され高発現する形質転換Sphingomonas sp. A1株を、アルギン酸を含む培地中で培養することを含む、アルギン酸を原料としてエタノールを生産する方法。

【請求項9】
アルギン酸資化に関するタンパク質及び酵素であるABCトランスポーター、アルギン酸結合タンパク質、エンド型/エキソ型アルギン酸リアーゼ、ケト酸還元酵素、キナーゼ及びアルドラーゼを有するSphingomonas sp. A1株にZymomonas mobilis由来のピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換Sphingomonas sp. A1株であZymomonas mobilis由来のピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子がSphingomonas sp. A1株由来のSPH2987遺伝子のプロモーターにより制御され高発現する、アルギン酸を原料としてエタノールを生産し得る微生物。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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