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多能性幹細胞の培養方法 外国出願あり

国内特許コード P150012429
整理番号 3526
掲載日 2015年10月16日
出願番号 特願2013-545970
登録番号 特許第5999658号
出願日 平成24年11月22日(2012.11.22)
登録日 平成28年9月9日(2016.9.9)
国際出願番号 JP2012080364
国際公開番号 WO2013077423
国際出願日 平成24年11月22日(2012.11.22)
国際公開日 平成25年5月30日(2013.5.30)
優先権データ
  • 61/563,643 (2011.11.25) US
発明者
  • 中辻 憲夫
出願人
  • 国立大学法人京都大学
発明の名称 多能性幹細胞の培養方法 外国出願あり
発明の概要 本発明は、(i) 多能性幹細胞を、細胞塊の平均直径が約200-約300 μmとなるまで浮遊培養する工程、および(ii) 工程(i)により得られた細胞塊を、平均直径が約80-約120 μmである均一な細胞塊に分割する工程を繰り返すことを特徴とする、多能性幹細胞の維持増幅方法を提供する。工程(i)では、浮遊細胞塊の移動および細胞塊同士の接着融合を防止するために、培地に適度な粘性が付与される。また、工程(ii)においては、細胞浮遊液をメッシュに通すことにより、細胞塊はより小さな均一の細胞塊に機械的に分割される。
従来技術、競合技術の概要


癌化などを起こすことなく無制限に増殖可能で多分化能を持つ多能性幹細胞は、細胞移植治療や創薬スクリーニングなどへの応用が期待されている。
従来、ヒト多能性幹細胞株は、フィーダー細胞または各種高分子などに接着させる平面培養によって増殖維持されてきた。しかしながら、高品質のヒト多能性幹細胞を、安定して大量に培養増殖させる技術は確立されていない。特に、実用化に必要となる大量の多能性幹細胞を調製するには、従来法である培養容器に接着させて継代により増殖させる方法では限界がある。例えば、ヒト多能性幹細胞用の接着基質材料として、品質面とコスト面で最適なものは開発されておらず、また、継代には複雑な多段階の操作が必要であり、通常は酵素処理など、安全面およびコスト面で不利なステップが含まれている。



最近、接着基質が不要な浮遊培養(suspension culture)法が報告され、注目されている(特許文献1-5, 非特許文献1-6)。この方法によれば三次元的な培養が可能なため、より小さなスペースでの大量培養が可能となる。しかしながら、既報の浮遊培養法では、付着培養と同じく継代時に酵素処理を必要とするため、継代操作が複雑で均一なサイズの細胞塊を作ることが困難であり、また、細胞塊同士が接着融合して細胞壊死や分化が始まるなど、適切な細胞塊サイズを安定的にコントロールすることが不可能であった。

産業上の利用分野


本発明は、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞の維持増幅方法に関する。より詳細には、本発明は、多能性幹細胞を、該細胞塊に分化や細胞死が誘導されない程度のサイズまで、浮遊培養により増幅させた後、該細胞塊を、細胞死を引き起こさない程度のより小さいサイズの細胞塊に分割して継代することによる、多能性幹細胞の維持増幅方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の工程を繰り返すことを特徴とする、多能性幹細胞の維持増幅方法。
(i) 多能性幹細胞を、細胞塊の平均直径が約200-約300 μmとなるまで浮遊培養する工程
(ii) 工程(i)により得られた細胞塊を、平均直径が約80-約120 μmである均一な細胞塊に分割する工程

【請求項2】
工程(i)において、多能性幹細胞を、細胞塊の平均直径が約250 μmとなるまで浮遊培養し、工程(ii)において、平均直径が約80 μmである均一な細胞塊に分割することを特徴とする、請求項1記載の方法。

【請求項3】
工程(ii)における分割が、細胞塊をメッシュに通すことにより行われることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。

【請求項4】
メッシュの孔径が約30-約70 μm、好ましくは約40-約60 μm、より好ましくは約50 μmである、請求項3記載の方法。

【請求項5】
工程(i)の培養が、細胞塊同士の接着を起こさない粘度を持つ水溶性高分子成分を含む培地中で行われる、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項6】
水溶性高分子が、多糖もしくはそのエーテル、合成ハイドロゲル高分子および生体高分子、並びにそれらを模倣した人工高分子から選ばれる、請求項5記載の方法。

【請求項7】
水溶性高分子がメチルセルロースまたは昇温型温度感受性ハイドロゲルである、請求項5記載の方法。

【請求項8】
多能性幹細胞がES細胞またはiPS細胞である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。

【請求項9】
多能性幹細胞がヒト由来である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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