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キメラ2重鎖核酸

国内特許コード P150012549
整理番号 (S2012-0215-N0)
掲載日 2015年11月19日
出願番号 特願2014-528740
公表番号 特表2015-502134
出願日 平成24年12月17日(2012.12.17)
公表日 平成27年1月22日(2015.1.22)
国際出願番号 JP2012083180
国際公開番号 WO2013089283
国際出願日 平成24年12月17日(2012.12.17)
国際公開日 平成25年6月20日(2013.6.20)
優先権データ
  • 特願2011-275488 (2011.12.16) JP
発明者
  • 横田 隆徳
  • 仁科 一隆
  • 小比賀 聡
  • 水澤 英洋
出願人
  • 国立大学法人 東京医科歯科大学
  • 国立大学法人大阪大学
発明の名称 キメラ2重鎖核酸
発明の概要 標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制する二重鎖核酸複合体、並びにそれを利用する方法を開示する。
細胞内の転写産物レベルを低減する、1の方法であって、
該細胞と組成物とを接触させる工程を含み、
該組成物は、第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体を含み、
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、
(ii)前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第2の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、方法。
従来技術、競合技術の概要


近年、オリゴヌクレオチドは、核酸医薬と称される医薬品としての開発が進められており、特に標的遺伝子の選択性の高さや低毒性の観点から、アンチセンス法を利用した核酸医薬の開発が精力的に進められている。アンチセンス法は、標的遺伝子のmRNA(センス鎖)の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO))を細胞内に導入することにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を選択的に阻害する方法である。



図1(上部)に示す通り、ASOとしてRNAからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合には、標的遺伝子の転写産物(mRNA)と当該ASOとが結合して、部分的に二本鎖が形成される。そして、この二本鎖が蓋の役割をして、リボソームによる翻訳を生じさせず、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害されることが知られている。



一方、ASOとしてDNAからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合には、部分的にDNA-RNAのヘテロオリゴヌクレオチドが形成される。そして、RNaseHによってこの部分が認識され、標的遺伝子のmRNAが分解されるため、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害される(図1、下部)。また、ASOとしてDNAを用いた方(RNaseH依存的経路)がRNAを用いるよりも、多くの場合において遺伝子発現の抑制効果が高いことも明らかになっている。



オリゴヌクレオチドを核酸医薬として利用する際には、標的RNAへの結合親和性の向上や生体内での安定性等を考慮し、ロックド核酸(Locked Nucleic Acid(LNA)(登録商標))等の様々な修飾核酸等が開発されている。



図2に示す通り、天然核酸(RNAやDNA)の糖部分は4つの炭素原子と1つの酸素原子とからなる5員環を有し、その糖部分はN型とS型の2種類のコンホメーションを取る。これらコンホメーションは互いに揺らいでおり、これにより核酸のらせん構造もA型とB型の異なった型をとることが知られている。前述のASOの標的となるmRNAは主に糖鎖がN型でA型のらせん構造をとっているため、RNAに対する親和性を高めるという観点から、ASOの糖鎖もN型をとることが重要になる。このコンセプトのもとに開発されたのがLNA(2’-O,4’-C-メチレン-架橋化核酸(2’,4’-BNA))等の修飾核酸である。例えば、LNAにおいては、2’位の酸素と4’位の炭素とをメチレン基によって架橋することにより、そのコンホメーションはN型に固定され、コンホメーション間のゆらぎは生じない。そのため、LNAを数ユニット組み込んで合成されたオリゴヌクレオチドは、従来の天然の核酸で合成されたオリゴヌクレオチドに比べて、RNAに対する結合力や配列特異性が極めて高く、かつ、優れた耐熱性とヌクレアーゼ耐性とを示す(特許文献1 参照)。他の人工核酸もかかる特性を有していることから、アンチセンス法の利用等において、人工核酸は強く注目されている(特許文献1~7 参照)。



また、オリゴヌクレオチドを医薬に適用する際には、当該オリゴヌクレオチドを標的部位に特異性高く効率良く送達できることが重要である。そして、オリゴヌクレオチドの送達方法として、コレステロールやビタミンE等の脂質を利用する方法(非特許文献1及び2)や、RVG-9R等の受容体特異的ペプチドを利用する方法(非特許文献3)や、標的部位に特異的な抗体を利用する方法(非特許文献4)が開発されている。

産業上の利用分野


本発明は、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制する活性を有する二重鎖核酸に関し、より詳しくは、4塩基以上の連続した核酸を含む領域を含む、標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸と、該核酸に相補的な核酸とを含む二重鎖核酸に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
細胞内の転写産物レベルを低減する方法であって、
該細胞と組成物とを接触させる工程を含み、
該組成物は、第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体を含み、
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、
(ii)前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第2の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、方法。

【請求項2】
第2の核酸鎖は、
(i)RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含み、
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
(iii)PNAヌクレオチドを含む
核酸鎖である、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
前記転写産物は、タンパク質をコードするmRNA転写産物である、請求項1又は2に記載の方法。

【請求項4】
前記転写産物は、タンパク質をコードしない転写産物である、請求項1又は2に記載の方法。

【請求項5】
請求項1~4のいずれか一項に記載の方法であって、第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの前記総数と、第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの総数とが同じである方法。

【請求項6】
請求項1~4のいずれか一項に記載の方法であって、第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの前記総数と、第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの総数とが異なる、方法。

【請求項7】
請求項6に記載の方法であって、第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの前記総数が、第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの前記総数よりも大きい、方法。

【請求項8】
請求項1~7のいずれか一項に記載の方法であって、第1の核酸鎖に含まれるヌクレオチドの総数が10~35ヌクレオチドである、方法。

【請求項9】
請求項1~8のいずれか一項に記載の方法であって、第1の核酸鎖が、RNaseHによって認識される前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’及び/又は3’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログを含む核酸鎖である、方法。

【請求項10】
請求項1~9のいずれか一項に記載の方法であって、第1の核酸鎖が、
RNaseHによって認識される前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、及び/又は、
RNaseHによって認識される前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの3’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域を含む核酸鎖である、方法。

【請求項11】
請求項10に記載の方法であって、第1の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び3’ウィング領域を含み、該5’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含み、かつ、該3’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含む核酸鎖である、方法。

【請求項12】
請求項11に記載の方法であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~10個のヌクレオチドアナログを含む、方法。

【請求項13】
請求項12に記載の方法であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~3個のヌクレオチドアナログを含む、方法。

【請求項14】
請求項1~13のいずれか一項に記載の方法であって、第1の核酸鎖が、2’-O-CH基又は2’-O-CHCHOCH(MOE)基を含むヌクレオチドを少なくとも1つ含む核酸鎖である、方法。

【請求項15】
請求項1~14のいずれか一項に記載の方法であって、第1の核酸鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログが架橋化ヌクレオチドである、方法。

【請求項16】
請求項15に記載の方法であって、第1の核酸鎖が、LNA、cEt-BNA、アミドBNA(AmNA)及びcMOE-BNAから独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、方法。

【請求項17】
請求項15に記載の方法であって、第1の核酸鎖が、4’-(CH-O-2’、4’-(CH-S-2’、4’-(CH-OCO-2’、4’-(CH-N(R)-O-(CH-2’によって、2’位の炭素と4’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから、独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、方法(p、m及びnは、各々1~4、0~2及び1~3の整数である。Rは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す)。

【請求項18】
請求項1~17のいずれか一項に記載の方法であって、第1の核酸鎖における少なくとも1つのヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、方法。

【請求項19】
請求項1~18のいずれか一項に記載の方法であって、第1の核酸鎖における少なくとも1つのヌクレオチドアナログがホスホロチオエート化されている、方法。

【請求項20】
請求項1~19のいずれか一項に記載の方法であって、第1の核酸鎖が、前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される4~20個の連続したヌクレオチドを含む核酸鎖である、方法。

【請求項21】
請求項20に記載の方法であって、第1の核酸鎖が、前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される4~20個の連続したヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドのうちの少なくとも1つがDNAヌクレオチドである、方法。

【請求項22】
請求項10~21のいずれか一項に記載の方法であって、
第1の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び3’ウィング領域を含み、
(i)該5’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、
(ii)該3’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、かつ、
(iii)前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される前記連続したヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである、方法。

【請求項23】
請求項1~22のいずれか一項に記載の方法であって、第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、12~25ヌクレオチドである、方法。

【請求項24】
請求項2~23のいずれか一項に記載の方法であって、第2の核酸鎖が、RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含む核酸鎖である、方法。

【請求項25】
請求項24に記載の方法であって、第2の核酸鎖が第1の核酸鎖にアニーリングした際に、RNaseHによって切断される、少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含む核酸鎖である、方法。

【請求項26】
請求項25に記載の方法であって、第2の核酸鎖が、前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’及び/又は3’側に、1又は複数のホスホロチオエート化されているヌクレオチドを含む核酸鎖である、方法。

【請求項27】
請求項25又は26に記載の方法であって、第2の核酸鎖が、前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’及び/又は3’側に、1又は複数のヌクレオチドアナログを含む核酸鎖である、方法。

【請求項28】
請求項26又は27に記載の方法であって、第2の核酸鎖が、
前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、及び/又は、
前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの3’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域を含む核酸鎖である、方法。

【請求項29】
請求項28に記載の方法であって、第2の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域を含み、該5’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含み、かつ、第1の核酸鎖における前記3’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含む核酸鎖である、方法。

【請求項30】
請求項29に記載の方法であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~10個のヌクレオチドアナログを含む、方法。

【請求項31】
請求項30に記載の方法であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~3個のヌクレオチドアナログを含む、方法。

【請求項32】
請求項24~31のいずれか一項に記載の方法であって、第2の核酸鎖が、2’-O-CH基又は2’-O-CHCHOCH(MOE)基を含むヌクレオチドを少なくとも1つ含む核酸鎖である、方法。

【請求項33】
請求項24~32のいずれか一項に記載の方法であって、第2の核酸鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログが架橋化ヌクレオチドである、方法。

【請求項34】
請求項33に記載の方法であって、第2の核酸鎖が、LNA、cEt-BNA、アミドBNA(AmNA)及びcMOE-BNAから独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、方法。

【請求項35】
請求項33に記載の方法であって、第2の核酸鎖が、4’-(CH-O-2’、4’-(CH-S-2’、4’-(CH-OCO-2’、4’-(CH-N(R)-O-(CH-2’によって、2’位の炭素と4’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから、独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、方法(p、m及びnは、各々1~4、0~2及び1~3の整数である。Rは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す)。

【請求項36】
請求項28~35のいずれか一項に記載の方法であって、
第2の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び3’ウィング領域を含み、
(i)該5’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、
(ii)該3’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、かつ、
(iii)第2の核酸鎖が第1の核酸鎖にアニーリングした際に、RNaseHによって切断される前記連続したヌクレオチドは、RNAヌクレオチドである、方法。

【請求項37】
請求項36に記載の方法であって、第2の核酸鎖において、少なくとも1つのRNAヌクレオチド及び又は少なくとも1つのヌクレオチドアナログが、ホスホロチオエート化されている、方法。

【請求項38】
請求項2~23のいずれか一項に記載の方法であって、第2の核酸鎖がPNAヌクレオチドを含む核酸鎖である、方法。

【請求項39】
請求項24~38のいずれか一項に記載の方法であって、第2の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、方法。

【請求項40】
請求項1~4及び6~33のいずれか一項に記載の方法であって、前記二本鎖核酸複合体が、第2の核酸鎖にアニーリングする第3の核酸鎖を更に含む複合体である、方法。

【請求項41】
請求項40に記載の方法であって、第3の核酸鎖は第1の核酸鎖と同じである、方法。

【請求項42】
請求項40に記載の方法であって、第3の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、
(ii)第2の転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)ヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、かつ
(iv)第2の転写産物にハイブリダイズする
核酸である、方法。

【請求項43】
請求項40に記載の方法であって、第3の核酸鎖はPNAヌクレオチドを含む核酸鎖である、方法。

【請求項44】
請求項40~43のいずれか一項に記載の方法であって、第3の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、方法。

【請求項45】
請求項39又は44に記載の方法であって、前記機能性部分が、脂質、ペプチド及びタンパク質から選択される分子である、方法。

【請求項46】
請求項45に記載の方法であって、前記機能性部分が、前記核酸鎖の3’末端のヌクレオチド又は5’末端のヌクレオチドに結合している、方法。

【請求項47】
請求項45又は46に記載の方法であって、前記機能性部分が脂質である、方法。

【請求項48】
請求項47に記載の方法であって、前記脂質が、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質及びグリセリドから選択される、方法。

【請求項49】
請求項47に記載の方法であって、前記機能性部分が、コレステロール、トコフェロール及びトコトリエノールから選択される脂質である、方法。

【請求項50】
請求項45又は46に記載の方法であって、前記機能性部分が、受容体のリガンド及び抗体から選択されるペプチド又はタンパク質である方法。

【請求項51】
哺乳動物における遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
該哺乳動物に、医薬組成物を有効量投与する工程を含み、
該医薬組成物は、(a)第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体と、(b)薬理学上許容される担体とを含み、
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、
(ii)前記遺伝子の転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第2の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、方法。

【請求項52】
請求項48に記載の方法であって、投与経路が経腸管的である、方法。

【請求項53】
請求項48に記載の方法であって、投与経路が非経腸管的である、方法。

【請求項54】
請求項51~53のいずれか一項に記載の方法であって、前記二本鎖核酸複合体の投与量が、0.001mg/kg/日~50mg/kg/日である、方法。

【請求項55】
請求項51~54のいずれか一項に記載の方法であって、前記哺乳動物がヒトある、方法。

【請求項56】
精製又は単離された二本鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含み、
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、
(ii)転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)少なくとも1つの非天然ヌクレオチドを含み、かつ、
(iv)前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第2の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、二本鎖核酸複合体。

【請求項57】
請求項56に記載の、精製又は単離された二本鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖は、
(i)RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含み、
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
(iii)PNAヌクレオチドを含む、二本鎖核酸複合体。

【請求項58】
哺乳動物を治療するための医薬組成物であって、前記転写産物が哺乳動物の転写産物であり、請求項56又は57に記載の二本鎖核酸複合体と、薬理学上許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項59】
哺乳動物において遺伝子の発現を低減するための薬剤を製造するための、請求項56及び57のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体の使用。

【請求項60】
哺乳動物において遺伝子の発現を低減するための、請求項56及び57のいずれかに記載の二本鎖核酸複合体の使用。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開
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